新型循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法在頭頸部惡性腫瘤中的臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　循環(huán)血液中活性腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)被看作是液體活檢，具有動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的功能，在腫瘤早期診斷、個(gè)體化治療、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后判斷等方面具有重要的臨床意義，然而由于其在血液中數(shù)量很少，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circlulating tumor cells,CTCs）的分離和鑒定成為臨床應(yīng)用的難點(diǎn)。復(fù)制選擇性溶腫瘤腺病毒Ad11-5ETel-GFP是一種通過同源重組獲得的病毒，可以選擇性的在具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)綠色熒光蛋白（Green

2、 Fluorescent Protein，GFP）。本研究旨在利用該病毒捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞，從而建立一種可重復(fù)、簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的可靠性和臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行探討。
　　方法：
　　首先通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證我們所建立的方法能夠有效捕獲到腫瘤細(xì)胞，包括：將AD11-5ETel-GFP病毒加入正常人外周血中，觀察GFP在正常白細(xì)胞的表達(dá)情況；將A549(肺癌細(xì)胞系)，SKBR3（乳腺癌細(xì)胞系）分別以10、50、100個(gè)細(xì)胞

3、三個(gè)梯度加入1ml人外周血中，建立循環(huán)腫瘤細(xì)胞的模型并檢測(cè)其回收率；使用抗人CD45抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)建立的新型檢測(cè)方法能有效的捕獲循環(huán)細(xì)胞。將該方法應(yīng)用于頭頸部惡性腫瘤的患者，收集臨床標(biāo)本48例，將標(biāo)本中紅細(xì)胞裂解，加入病毒于37℃條件下孵育24h，固定涂片后于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。并分析不同臨床參數(shù)頭頸部腫瘤患者術(shù)前外周血CTCs的檢出情況。
　　結(jié)果：
　　1.復(fù)制選擇性溶腫

4、瘤病毒不感染正常人白細(xì)胞。
　　2.分別于正常人外周血中加入的10，50,100個(gè)A549、SKBR3細(xì)胞，其檢出率分別為77.5％，84.0%，80.25%；80.0%，82.5%，81.25%，應(yīng)用pearson卡方檢驗(yàn)比較兩組間差異，結(jié)果顯示用溶腫瘤腺病毒法檢測(cè)兩組不同的腫瘤細(xì)胞，其檢出率無(wú)顯著差異，即本實(shí)驗(yàn)所研究的方法對(duì)各腫瘤細(xì)胞系均敏感且回收率較高。并通過細(xì)胞免疫染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證所捕獲的細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
　　

5、3.在收集的48例頭頸部惡性腫瘤的臨床標(biāo)本中，19例患者CTCs陽(yáng)性，檢出率為39.6%，且CTCs的檢出率與性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤的發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等臨床參數(shù)無(wú)關(guān)，與腫瘤分化程度相關(guān)，腫瘤分化越差，CTCs的檢出率越高。
　　結(jié)論：
　　本研究建立了一種新型循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法，初步確定了溶腫瘤腺病毒檢測(cè)CTCs的標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)該方法的可靠性及臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了評(píng)估。該方法能夠特異性示蹤循環(huán)腫瘤細(xì)胞，具有重要的臨