紅笛鯛清道夫受體B型Ⅰ類和抗凍蛋白Ⅱ型基因的克隆、表達(dá)與定量分析.pdf

1、本論文以紅笛鯛(Lutjanus sanguineus)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,根據(jù)NCBI上已經(jīng)登錄的已知序列,設(shè)計(jì)特異性簡(jiǎn)并引物,利用RACE技術(shù),獲得了道夫受體B型Ⅰ類(Scavenge Receptor class B typeⅠ,SR-BⅠ)和抗凍蛋白Ⅱ型(Antifreeze ProteinsⅡ,AFPⅡ)基因全長(zhǎng),并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:SR-BⅠ基因的cDNA開放閱讀框長(zhǎng)度為966bp,編碼一個(gè)由233個(gè)氨基酸殘基組成

2、的蛋白質(zhì),其分子量計(jì)算值為36.735kDa,理論等電點(diǎn)(PI)為8.75；紅笛鯛AFPⅡ基因的cDNA序列全長(zhǎng)990bp,開放閱讀框(ORF)609bp,編碼一個(gè)由203個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),其分子量計(jì)算值為22.45kDa,理論等電點(diǎn)為5.52。
　　 在克隆AFPⅡ全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-AFPⅡ,將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21后進(jìn)行蛋白的表達(dá)條件的篩選。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度的優(yōu)化,最終確定AFPⅡ蛋

3、白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化條件為:IPTG濃度為0.7mmol/L,37℃誘導(dǎo)3h。
　　 用Real-time PCR對(duì)溶藻弧菌免疫后紅笛鯛S R-BⅠ基因在不同組織里的表達(dá)水平差異進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)溶藻弧菌免疫后S R-BⅠ在紅笛鯛的頭腎、脾臟、肝臟、腸、心臟、胸腺組織中的表達(dá)量均有變化,其中腸中表達(dá)量明顯高于其他組織,肝臟次之,然后依次是頭腎、心臟、脾臟,胸腺中表達(dá)量最少。
　　 利用Real-time PCR

4、研究了水溫對(duì).AFPⅡ表達(dá)量的影響。選擇3條健康紅笛鯛放入17℃養(yǎng)殖池中30min,以水溫25℃為對(duì)照組,提取頭腎、胸腺、肝臟、脾臟、鰓、腸六個(gè)組織總RNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫刺激后各個(gè)組織的表達(dá)量均有所變化,腸和肝臟的AFPⅡ表達(dá)量都是實(shí)驗(yàn)組大于對(duì)照組,而頭腎、胸腺、脾臟、鰓中則是對(duì)照組的表達(dá)量大于實(shí)驗(yàn)組。
　　 本論文主要是在紅笛鯛SR-BⅠ和AFPⅡ基因的克隆和表達(dá)內(nèi)容上進(jìn)行了研究與探討,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為紅笛鯛脂肪代謝疾病的防治提供