家蠶微孢子蟲單克隆抗體G9靶蛋白的鑒定.pdf

1、微孢子蟲(Microsporidia)是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生的單細(xì)胞真核生物，與其他細(xì)胞內(nèi)寄生蟲相似，微孢子蟲具特有的侵染機(jī)制。家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)是Nag(e)li于1857年在病蠶中分離鑒定到的，它能夠感染家蠶，引發(fā)家蠶微粒子病，是蠶業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性病害，因此如何在家蠶感染早期檢測(cè)出家蠶微孢子蟲并進(jìn)行防治，在蠶業(yè)上至關(guān)重要。
　　 1870年，巴斯德創(chuàng)立了母蛾鏡檢法來檢測(cè)家蠶微孢子蟲，多年來此方法一直沿

2、用至今，是生產(chǎn)上用于檢測(cè)的傳統(tǒng)方法。截止目前，家蠶微孢子蟲的檢測(cè)經(jīng)歷了以下階段:顯微鏡檢、分子生物學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)。母蛾鏡檢方法具有簡便、快速、不需要高端儀器的優(yōu)點(diǎn)，但是此方法依賴檢驗(yàn)人員的判斷，主觀性強(qiáng)?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)利用染色可以提高微孢子蟲的檢出率。透射電子顯微鏡可以觀察到孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)孢子壁厚度、極管圈數(shù)與傾角等基本確定微孢子的種類。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)、LAMP（環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）被用

3、到微孢子蟲檢測(cè)上來。近年來，針對(duì)微孢子蟲種間孢壁蛋白抗原性的不同，逐步發(fā)展起了一些免疫學(xué)檢測(cè)方法。膠體金免疫層析(GICA)就是利用膠體金本身的顯色特點(diǎn)結(jié)合免疫層析技術(shù)對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。利用這一原理研制的快速檢測(cè)試紙?jiān)卺t(yī)學(xué)診斷、病原檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用。2009年本實(shí)驗(yàn)室利用的家蠶微孢子蟲單克隆抗體G9和孢子發(fā)芽液的兔多抗組裝了試紙條，分別對(duì)孢子、感染孢子的母蛾進(jìn)行了檢測(cè)，但還有基礎(chǔ)問題未得到解決，包括試紙條的特異性以及單抗針對(duì)的

4、靶蛋白都未確定。
　　 基于以上問題，本文對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、靈敏性的分析，利用免疫沉淀結(jié)合LTQ質(zhì)譜分析的方法找到了單克隆抗體G9的靶蛋白。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶微孢子蟲檢測(cè)試紙靈敏性及特異性分析
　　 由于前期實(shí)驗(yàn)室制備的試紙條采用的是將孢子堿處理發(fā)芽后的混合物用點(diǎn)膜的方法檢測(cè)的，試紙條檢測(cè)的靶標(biāo)存在孢子堿處理后的上清還是沉淀中，尚不清楚，于是我們對(duì)孢子堿處理后的組分進(jìn)行分析，將堿處理的上清和沉

5、淀分開檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)試紙條檢測(cè)靶標(biāo)存在于堿處理后的上清中。對(duì)檢測(cè)試紙的檢測(cè)性能進(jìn)行分析，開展了特異性性和靈敏性實(shí)驗(yàn)。特異性實(shí)驗(yàn)方面，將柞蠶微孢子蟲(Nosemaantheraeae)、家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclearpolyhydrosisvirus，BmNPV)、家蠶變形微孢子蟲(Vairimorphabombycis)在試紙條上進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)家蠶核型多角體病毒出現(xiàn)非特異性信號(hào)。靈敏性實(shí)驗(yàn)中，用0.1mol/L的KO

6、H溶液20μL分別處理約108、107、106、105個(gè)孢子，在試紙條上經(jīng)點(diǎn)膜法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)孢子數(shù)量為108、107個(gè)時(shí)才能夠在試紙條上出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次，均得出相同結(jié)果。然后用Bradford法測(cè)堿處理約108、107個(gè)孢子堿處理后上清中蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)兩次測(cè)得的平均值分別是1.76μg/μL、0.17μg/L。說明試紙條檢測(cè)的最低檢測(cè)量為0.17μg/μL。
　　 2.家蠶微孢子蟲堿溶處理?xiàng)l件的優(yōu)化
　　

7、由于試紙條檢測(cè)靶標(biāo)存在于堿處理后的上清中，因此本章中對(duì)堿處理后的上清（堿溶蛋白）進(jìn)行研究，同時(shí)探索堿溶蛋白的最佳提取條件。首先對(duì)堿溶蛋白特異條帶進(jìn)行LTQ質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示是SWP1。對(duì)不同堿性溶液、不同濃度、不同時(shí)間、不同溫度、不同pH、不同家蠶發(fā)育階段提取孢子的條件下提取的堿溶蛋白進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)用氫氧化鉀、氫氧化鈉以及碳酸鉀提取的堿溶蛋白均在大小為30kDa處有主帶。不同濃度堿性溶液處理時(shí)，30kDa附近主帶首先出現(xiàn)，隨著濃度增大

8、，蛋白條帶變豐富。不同處理時(shí)間條件下分析堿溶蛋白，發(fā)現(xiàn)處理5min之后堿溶蛋白就可以在電泳上檢測(cè)到條帶，處理90min后蛋白條帶不會(huì)增加，且90min以內(nèi)在66kDa附近有蛋白條帶出現(xiàn)，90min以后消失。從溫度對(duì)堿溶蛋白的影響實(shí)驗(yàn)中可以看出60℃處理時(shí)15kDa附近出現(xiàn)單一的蛋白條帶。在研究pH對(duì)堿溶蛋白的影響時(shí)，我們用0.1mol/L的KOH溶液提取堿溶蛋白，再將堿溶蛋白的pH用鹽酸中和，分別調(diào)pH到8、9、10，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH

9、變化時(shí)，堿溶蛋白的組分是穩(wěn)定的。堿處理家蠶不同生活史時(shí)期提取的孢子時(shí)，發(fā)現(xiàn)在家蠶蛹期純化的孢子中提取的堿溶蛋白30kDa附近蛋白量最多。本章節(jié)的研究對(duì)堿溶蛋白的組分有了初步了解并且探索到提取堿溶蛋白的最佳條件為:4℃，用0.1mol/LKOH或者NaOH溶液，處理時(shí)間不超過90min。
　　 3.家蠶微孢子蟲單克隆抗體G9靶蛋白的鑒定分析
　　 由結(jié)果可知，試紙條能檢測(cè)到的靶標(biāo)存在于堿溶蛋白中，堿溶蛋白在試紙條上有檢測(cè)信

10、號(hào)，并且堿溶蛋白的主要組分是SWP1，而試紙條上使用的金標(biāo)抗體是由單抗G9與膠體金結(jié)合而來，那么單抗G9的靶蛋白必然存在于堿處理后的上清中，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了并開展了免疫沉淀、Westernblotting等實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)用堿溶蛋白與MAbG9進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)，單抗G9能從堿溶蛋白中沉淀出一條大小約為30kDa的蛋白，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為SWP1。為進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)譜的結(jié)果，用重組SWP1兔抗與免疫沉淀的結(jié)果進(jìn)行Westernblotting，

11、結(jié)果顯示SWP1兔抗能識(shí)別免疫沉淀中特異的30kDa附近條帶。隨后利用重組SWP1兔抗與堿溶蛋白進(jìn)行Westernblotting實(shí)驗(yàn)、重組SWP1兔抗和MAbG9分別與堿溶蛋白進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均與免疫沉淀的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上，證明單抗G9針對(duì)SWP1。確認(rèn)了MAbG9的靶蛋白，就可以純化和富集該蛋白制備該蛋白的高效價(jià)多抗，應(yīng)用于試紙條上作為攔截線，改良點(diǎn)膜法，為進(jìn)一步提高試紙條的靈敏性和特異