DDRT-PCR技術分析甜菜鹽脅迫相關基因差.pdf

1、影響作物產(chǎn)量的因素眾多,其中主要問題之一是土壤鹽漬化,并且土壤鹽漬化目前有明顯的嚴重和擴大趨勢。甜菜在全世界很多地區(qū)均有種植,是重要的產(chǎn)糖經(jīng)濟作物。相對于其他作物,甜菜具有較好的耐鹽堿性。研究甜菜耐鹽性,進一步從分子水平上認識甜菜耐鹽堿機理,發(fā)現(xiàn)并得到更多的甜菜耐鹽基因,有利于對于提高栽培甜菜及其他植物的耐鹽性、豐富耐鹽基因資源意義重大。
　　本研究以耐鹽甜菜品系“O”68為材料,經(jīng)高鹽(300mM濃度NaCl)處理后利用改進的D

2、DRT-PCR技術和銀染技術對在正常條件下與高鹽條件下甜菜葉片進行不同處理條件下的mRNA差異顯示分析,以期找到有價值的耐鹽相關基因,并對這些差異表達的cDNA片段進行克隆、測序和功能鑒定。
　　為得到甜菜高鹽誘導表達的基因片段,利用RNA提取試劑盒提取處理組和對照組葉片總RNA,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性并利用分光光度計檢測RNA樣品的純度后,反轉錄合成cDNA,以cDNA為模板,利用26條隨機引物與3條錨定引物Oligo(d

3、T)10G(C或A)組合成78對引物組合進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測并采取銀染法顯色。共獲得擴增條帶一千余條,差異條帶50條,其中上調15條,下調35條,選取差異片段回收并進行二次擴增,對回收的片段利用Northern雜交驗證,陽性結果進行克隆、測序、NCBI上比對以及同源性分析,本研究共獲得12條耐鹽相關cDNA片段,涉及葉綠體mRNA及tRNA、SOS信號通路蛋白cDNA、NADH脫氫酶cDNA、硫鐵蛋白