天藍(lán)色鏈霉菌離子通道蛋白MscL及脅迫調(diào)節(jié)因子SigN的生物學(xué)功能.pdf

1、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，由于具有復(fù)雜的形態(tài)發(fā)育和生理分化過(guò)程，同時(shí)能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，已成為研究鏈霉菌的模式菌株，其基因組已于2002年測(cè)序完成。天藍(lán)色鏈霉菌作為一種典型的土壤細(xì)菌，在生長(zhǎng)和生理代謝中常受到環(huán)境脅迫作用，長(zhǎng)期進(jìn)化形成了一套完整的脅迫調(diào)控機(jī)制。對(duì)這些脅迫調(diào)控機(jī)制的深入研究，有助于我們更加清晰地理解微生物與人類(lèi)和諧共存的意義，以及更好地將這些微生物為我所用。

2、 本課題選擇了典型的脅迫調(diào)控離子通道蛋白(Larger conductanceMechanosensitive channel，MscL)和Sigma factor(σ<'N>)為研究對(duì)象進(jìn)行闡述，為深入剖析復(fù)雜的環(huán)境脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系提供基礎(chǔ)。 首先選取實(shí)驗(yàn)室條件下的滲透壓改變作為一種模式脅迫條件，對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌生長(zhǎng)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括高滲脅迫對(duì)菌體次級(jí)代謝的影響、低滲脅迫對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響、不同溶質(zhì)造成的滲透壓改變對(duì)菌體產(chǎn)

3、生的不同影響以及細(xì)胞相容性物質(zhì)(游離氨基酸、離子、甜菜堿)的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl是實(shí)驗(yàn)室最佳模擬滲透壓改變的溶質(zhì)、高滲脅迫會(huì)造成菌體次級(jí)代謝的提前；低滲脅迫對(duì)菌體造成的影響經(jīng)24h基本可以恢復(fù)到正常水平，低滲脅迫梯度越大，對(duì)菌體的生長(zhǎng)抑制也越大，細(xì)胞相容性物質(zhì)中參與低滲脅迫的物質(zhì)主要有Na<'+>、K<'+>，谷氨酰胺和甜菜堿。基于上述研究，對(duì)滲透壓脅迫的調(diào)控因子MscL和σ<'N>分別進(jìn)行研究。 通過(guò)與大腸桿菌大電導(dǎo)率

4、機(jī)械敏感性離子通道(Ec-MscL)編碼基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌中存在同源性較高的基因SC03190，推測(cè)其編碼大電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道，并將其編碼蛋白命名為Sc-MscL。通過(guò)scmscl敲除、體內(nèi)與體外分別表達(dá)Sc-MscL對(duì)Sc-MscL的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明Sc-MscL能專(zhuān)一性應(yīng)對(duì)NaCl產(chǎn)生的低滲脅迫反應(yīng)，Sc-MscL缺失造盛菌體孢子產(chǎn)生提前，且放線菌紫素(blue pigmented polyketide

5、 actinorhodin，Act)的產(chǎn)量降低；體內(nèi)過(guò)量表達(dá)Sc-MscL致使菌落形態(tài)變小、皺褶減少，且Act產(chǎn)量增加。利用大腸桿菌成功表達(dá)了GST和His融合的膜蛋白Sc-MscL，通過(guò)凝血酶酶切獲得單一的Sc-MscL蛋白；體外Cross-linking試驗(yàn)證明，Sc-MscL和其他的菌株同源蛋白一樣呈現(xiàn)出保守的五聚體結(jié)構(gòu)。這是首次對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌離子通道MscL的生化特性和生理功能進(jìn)行研究，取得了初步研究成果。 另一方面，基

6、因組信息分析顯示天藍(lán)色鏈霉菌內(nèi)存在大量的σ因子，這些σ因子大多是可選擇性的，即在特定的條件下開(kāi)啟，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。其中，σ<'B>家族是比較重要的σ因子。本論文研究結(jié)果表明，σ<'B>家族中的σ<'N>與天藍(lán)色鏈霉菌的氣生菌絲、孢子產(chǎn)生和抗生素合成密切相關(guān)，σ<'N>敲除后菌體在脅迫條件下的生長(zhǎng)(鹽、酸、氧化、乙醇、冷激、熱激)受到不同程度的抑制，且在氧化脅迫、酸脅迫和冷激條件下，菌體的生長(zhǎng)周期相對(duì)于野生型的生長(zhǎng)周期發(fā)生了改變。通過(guò)