喉癌雙向途徑靶向基因治療的研究.pdf

1、目的：喉癌是上呼吸道常見惡性腫瘤。喉癌患者的生存率并未隨著近三十年來醫(yī)療技術(shù)的進步而明顯改善。部分晚期喉癌患者失去了根治性手術(shù)的機會，治療需要依靠放化療，該部分患者生存率較低。因此，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討高效低毒的喉癌治療新方法具有臨床實際意義?；蛑委熥鳛樯镏委煹闹匾M成部分，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究，它能否為喉癌的治療帶來了新的希望值得研究探討。腺病毒是基因治療中常用的基因載體，通過腫瘤特異性啟動子調(diào)控目的基因的表達，可

2、以實現(xiàn)重組腺病毒對腫瘤組織的靶向性。在前期的研究中，我們證實了分泌性白細胞蛋白酶抑制因子(Secretory Leukoprotease Inhibitor, SLPI)啟動子調(diào)控的重組腺病毒具有良好的喉癌組織靶向性。細胞的增殖失控和凋亡受阻共同促成惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此腫瘤基因治療可以從抑制細胞增殖和促進細胞凋亡兩方面著手。表皮生長因子受體(EpidermalGrowth Factor Receptor, EGFR)在頭頸部鱗狀細胞

3、癌（Head and Neck Squamous CellCarcinoma，HNSCC)中過度表達，是其惡性表現(xiàn)的重要分子機制之一，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及疾病預(yù)后關(guān)系密切。EGFR是近年來HNSCC生物治療的熱門靶點。分子靶向藥物易因EGFR過表達、降解障礙和靶點突變等原因?qū)е履退?。通過RNA干擾技術(shù)可以下調(diào)EGFR的表達從而抑制腫瘤細胞增殖，并可避免上述耐藥現(xiàn)象。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）在細胞凋亡信號傳遞中

4、居核心地位。重組活化型Caspase-3(revCasp3)是由人體天然Caspase-3經(jīng)人工重組而來，它不需上游分子的切割活化就能自發(fā)折疊成活性狀態(tài)，直接誘導(dǎo)細胞凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn)，用SLPI啟動子調(diào)控重組活化型Caspase-3在喉癌細胞中表達能夠特異性有效抑制喉癌。本文設(shè)計以重組腺病毒為載體，用喉癌特異性的SLPI啟動子調(diào)控以EGFR為靶點的人工microRNA和重組活化型Caspase-3，與臨床一線藥物順鉑(DDP)和西妥昔

5、單抗(Cetuximab)相比較，研究該重組腺病毒對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的體、內(nèi)外抑制作用，探討該雙向途經(jīng)基因治療策略抑制喉癌的效果。
　　方法：①構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA-SLPI-revCasp3-TAG-pA和pDC312-SLPI-GFP-pA，分別與骨架質(zhì)粒pBGHlox(delta)E1，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行腺病毒包裝。 PCR鑒定重組腺病毒Ad-SLPI

6、-EGFRamiR-SLPI-revCasp3（簡寫為Ad-EC），和Ad-SLPI-GFP（簡寫為Ad-GFP）。擴增病毒，CsCl密度梯度離心法純化病毒，TCID50法測定病毒滴度。病毒分別感染Hep-2細胞和人正常成纖維細胞(Normal Fibroblast，NF)，用熒光顯微鏡、流式細胞儀和Western blot檢測目的基因的表達。②將Ad-EC、Ad-GFP、DDP、Cetuximab以及Ad-EC+DDP合用分別作用于H

7、ep-2，用MTT，流式細胞儀和iCELLigence實時無標(biāo)記動態(tài)細胞分析技術(shù)(Real Time Cellular Analysis，RTCA)檢測Hep-2細胞的增殖和凋亡，用Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達水平。③建立喉癌荷瘤裸鼠模型，分為Ad-EC、Ad-GFP、DDP、Cetuximab、Ad-EC+DDP以及PBS六個處理組，比較用藥過程中各組腫瘤體積變化、體重變化及觀察末期瘤體重量。microPET檢測每組活體

8、腫瘤的代謝情況。
　　結(jié)果：⑴腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功后與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，13天左右出毒，PCR檢測示Ad-EC擴增出revCasp3大小亞基879bp片段，Ad-GFP擴增出1482bp片段，示重組腺病毒Ad-EC及對照病毒Ad-GFP構(gòu)建成功。予擴增、純化后行滴度測定，Ad-EC滴度為6.3×109pfu/ml，Ad-GFP為3.89×1010pfu/ml。重組腺病毒Ad-GFP感染72小時后，熒光顯微鏡下可見大

9、量Hep-2細胞呈現(xiàn)較強的綠色熒光信號，而NF細胞無明顯綠色熒光;流式細胞儀檢測見Hep-2細胞綠色熒光陽性率45％,NF細胞僅12％。Western blot結(jié)果顯示Ad-EC病毒作用72小時的Hep-2細胞EGFR蛋白表達減少，活化Caspase-3表達增多;而在NF細胞中無如上變化。表明SLPI啟動子能夠調(diào)控目的基因在Hep-2細胞中特異性表達。72小時為合適的感染時間。⑵MTT結(jié)果顯示，重組腺病毒Ad-EC對Hep-2的增殖有較

10、強的抑制作用且呈量效關(guān)系，MOI50感染72小時的抑制率為44.0％。DDP對Hep-2有較強的抑制作用，當(dāng)其與Ad-EC合用時，效果明顯升高。Cetuximab和Ad-GFP對Hep-2的增殖抑制作用均較低。⑶Ad-EC MOI50感染Hep-272hr后能顯著誘導(dǎo)Hep-2凋亡（凋亡率36.1％），并且明顯高于其他單用組，P均＜0.001（DDP0.25μg/ml組凋亡率13.5％; Cetuximab500μg/ml組為3.5％;

11、 Ad-GFP MOI50組為6.5％）。而當(dāng)與DDP合用時，凋亡率提高至61.2％，顯著高于Ad-EC和DDP單用組（P均＜0.001）。⑷Cell index(CI)值反映培養(yǎng)皿底部的電極因細胞貼壁形成的阻抗變化。Ad-ECMOI50組平臺期CI值為3.3-3.5，DDP0.25μg/ml組為2.8-3.0，均低于陰性對照組3.5-3.7，表現(xiàn)出一定的生長抑制作用;在Ad-EC+DDP合用組，CI值從用藥36hr后的最高值3.7持續(xù)

12、滑落，一直到96hr結(jié)束檢測時的1.0，并仍保持下降趨勢，提示合用組具有更高效的細胞毒性作用。⑸Ad-EC MOI50感染Hep-2細胞72hr后能使EGFR表達下調(diào)，活化Caspase-3表達升高及PARP(polyADP-ribose polymerase)剪切增多。在與DDP合用時上述變化更顯著。⑹Ad-EC以MOI50瘤內(nèi)注射，與PBS對照組相比，用藥30天后腫瘤體積和瘤重明顯降低(P＜0.05)，葡萄糖攝取減少，而裸鼠體重、日

13、常行為等與對照組相仿。DDP組腫瘤體積和瘤重較對照組顯著降低(P＜0.05)，但裸鼠體重較對照組減輕(P＜0.05)。Ad-EC與DDP合用后加強了腫瘤抑制作用，然而對裸鼠體重增長的影響也較DDP組更加明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論：①荷載有SLPI啟動子調(diào)控下的針對EGFR的人工microRNA和重組活化型Caspase-3的重組腺病毒Ad-EC構(gòu)建成功。②體外實驗顯示重組腺病毒Ad-EC能有效抑制喉癌細胞的生長和誘導(dǎo)細胞凋亡