Notch信號傳導途徑與腫瘤基因治療相關性的研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類死亡的主要原因之一，手術、放療和化療等傳統(tǒng)的治療方法對腫瘤治療的效果不甚理想。從根本上來說，惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展仍然源于體內基因表達的異常，因此，基因治療才是人類徹底征服腫瘤的希望。關于腫瘤的基因治療研究包括許多方面，其中從分子水平上徹底了解各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制仍然是不可逃避的問題。由于生物系統(tǒng)的高度復雜性，目前發(fā)現(xiàn)腫瘤的相關基因眾多，Notch信號傳導途徑也被越來越多的實驗室證明其與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關系密切，盡管目

2、前對其本身的生物學作用尚未有個明確的定義。Notch基因編碼一個跨膜的異二聚體受體，受體激活后引起的一系列細胞內的分子信號的改變稱為Notch途徑，正常情況下Notch途徑的功能和參與調節(jié)細胞生長、穩(wěn)定分化和凋亡有關。近來在許多腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)Notch基因表達的失常，且失控的Notch途徑在維持腫瘤表型方面起著重要作用。本研究通過RNA干擾Notch1的方法和重組逆轉錄病毒過表達Notch1活性部分的方法對。Notch途徑與不同腫瘤細

3、胞相關性作了初步探討，并利用RNA干擾的方法進行了針對Notch1的基因治療的嘗試。 一、RNA干擾阻斷Notch途徑對腫瘤生長的影響。 本部分實驗通過RNA干擾(RNAi)的方法對一系列現(xiàn)有的腫瘤細胞進行相關性研究，實驗設計了兩種siRNA分別針對PSl和Notchl蛋白，試圖在不同水平阻斷Notch信號通路以找出Notch和這些腫瘤之間的關系，實驗證明通過對PSl和Notchl的干擾能引起細胞內Notch信號的下調，

4、并造成腫瘤細胞的增殖抑制，而對正常細胞沒有明顯的影響。細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)增殖抑制的腫瘤細胞出現(xiàn)不同程度的G1/S阻滯，還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的這種增殖抑制現(xiàn)象在不同細胞間也存在較大的差異，推測在不同細胞中存在著不盡相同的機制。最后選取皮下注射Hela細胞致瘤的裸鼠進行了裸siRNA瘤內注射的動物實驗，成功抑制了腫瘤模型的生長，是為對Notch基因用于RNA干擾基因治療的可行性研究的一次有益的嘗試。 二、外源性Notchl胞內段的過表達對腫

5、瘤生長的影響。 本節(jié)實驗利用帶有Notchl胞內活性部分(ICN)的重組逆轉錄病毒介導目的細胞過表達ICN，模擬細胞Notch途徑上調的情況，實驗中發(fā)現(xiàn)Notch信號的上調在不同腫瘤細胞中會引起不同的效應。在Hela和HepG2細胞的MTS檢測中仍然出現(xiàn)增殖抑制，而在BGC-823細胞中，過表達的ICN則對細胞增殖起著促進作用。除此之外，差異還表現(xiàn)在細胞早期凋亡和細胞的周期檢測上，Hela和HepG2檢測不到早期凋亡的變化，而B

6、GC-823可檢測到一定程度的早期凋亡；Hela和HepG2在細胞周期檢測中出現(xiàn)了明顯的G1/S阻滯現(xiàn)象，而BGC-823則表現(xiàn)為S期細胞顯著增加。在對Notchl和PSl的相關性進行進一步研究時，發(fā)現(xiàn)Notchl的過表達能引起腫瘤細胞內PSl表達的下調，而對Notchl和PSl的干擾實驗卻都不能引起對方表達的變化，并且這一簡單的反饋機制在正常的永生化細胞中檢測不到，推測這一調節(jié)機制很可能僅存在于腫瘤細胞系中，其中的機制影響著Notch

7、信號傳導途徑對腫瘤細胞和非腫瘤細胞的不同作用。 三、可調控RNA干擾載體的構建與功能研究。 利用PCR的方法從pGL3-TRTP載體上擴增TRTP413啟動子片斷，并替換pBSl85 CRE蛋白表達載體上的CMV啟動子，構建TRTP-CRE表達載體。利用受CRE重組調控的RNA干擾載體pSico和pSicoR構建針對GAPDH和Notchl的shRNA表達載體：pSico-GAPDH、pSicoR-GAPDH、pSico