一種新的哺乳動物細胞表達載體的構建.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文一種新的哺乳動物細胞表達載體的構建姓名：王曉蓉申請學位級別：博士專業(yè)：醫(yī)學指導教師：沈(王羽)(王非)2000.6.1目前常用的基因表達系統(tǒng)多為病毒、細菌或酵母類表達系統(tǒng)，其優(yōu)點在于表達效率高，如原核表達系統(tǒng)中目的基因的蛋白表達量可達到菌體總蛋白的3050％。但此類表達系統(tǒng)對真核基因尤其是哺乳動物的基因進行表達時，往往不能進行正確的翻譯后加工，因而大大降低了基因表達產物的生物活性。而哺乳動物細胞的外源基因表達

2、系統(tǒng)的表達效率通常很低，其中一個關鍵問題在于缺乏一種高效的表達載體。另一方面，現有的用于哺乳動物細胞的基因表達載體，多采用病毒性的啟動子，如CMV、SV40啟動子，病毒性啟動子的應用有其局限性，例如，在基因治療中，病毒性載體的成分有可能與體內基因發(fā)生重組，因而可能導致遺傳性的突變或存在潛在的致病性。因此，有必要發(fā)展一種高效、安全而且適用范圍較廣的的真核基因表達載體，提高哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的效率。熱休克蛋白是一類進化上保守的蛋白質，它們

3、以分子伴侶的形式在細胞內發(fā)揮其生理功能，并參與細胞應激保護和應答過程。本組以往的研究證實，hsp9013基因的5’上游區(qū)，第一外顯子和第一內含子的片段可以介導報告基因在T淋巴細胞中的高組成性表達，并能被熱激和絲裂原誘導。經過優(yōu)化重組，篩選出具有高效表達活性的重組調控序列，其轉錄活性高于CMV、RSV及SV40啟動子。以此作為啟動子，構建了高效表達重組質粒P61。但上述人源性高效表達重組啟動子質粒P61的其它一些元件仍是病毒性，本論文就是

4、在此基礎上，對其進行改建，刪除載體中病毒成分，代之以人類基因中的有效元件，構建成高效表達載體pPS61：1、目的片段的擴增與克隆從Jurkat細胞中提取基因組DNA，確定擴增序列，設計引物，通過PCR方法從基因組DNA中擴增出目的片段，將其克隆到Tvector，成為過渡質粒T600。2、人源性啟動子的高效表達質粒P61的改建對本組構建的含人源性高效表達啟動子的質粒P61進行改建，刪去原質粒中用于檢測啟動子活性的氯霉素乙?；D移酶(CAT