髓系腫瘤中DLX4基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制及其臨床意義.pdf

1、目的：探究急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、慢性髓細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）和骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）三種髓系腫瘤患者中DLX4（distal-less homeobox4）表達(dá)和啟動子甲基化態(tài)勢，同時分析其相關(guān)性和臨床意義。
　　方法：應(yīng)用實時定量PCR（real-time quantitat

2、ive PCR，RQ-PCR）檢測37例正常人、102例AML患者及56例CML患者骨髓單個核細(xì)胞中DLX4轉(zhuǎn)錄本水平。應(yīng)用實時定量甲基化特異性PCR（real-time quantitative methylation-specific PCR， RQ-MSP）方法檢測52例正常人、173例AML患者、87例CML患者及103例MDS患者骨髓單個核細(xì)胞中DLX4啟動子甲基化水平。同時應(yīng)用亞硫酸氫鹽測序PCR（bisulfite seq

3、uencing PCR，BSP）方法驗證有標(biāo)本中的DLX4甲基化密度。應(yīng)用去甲基化藥物5-氮-2’-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-dC）對人髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株（K562、THP1、Kasumi-1）進行處理觀察DLX4表達(dá)和甲基化的改變并分析其相關(guān)性。
　　結(jié)果：AML患者中BP1（DLX4轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體1）的表達(dá)水平顯著高于對照組（中位0.034和0.000，P<0.001），然而，AML患者

4、中DLX7（DLX4轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體2）的表達(dá)較對照組呈顯著下調(diào)（中位0.001和0.265，P<0.001）。BP1高、低表達(dá)組患者的性別、年齡、外周血血紅蛋白、外周血血小板、骨髓原始細(xì)胞比例、FAB分型、核型、核型分組及常見基因突變均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。然而，BP1高表達(dá)組患者外周血白細(xì)胞計數(shù)高于 BP1低表達(dá)組患者（P=0.053）。無論是全部AML還是非M3患者（non-M3-AML）中，BP1高表達(dá)組患者的完全緩解（co

5、mplete remission，CR）率顯著低于BP1低表達(dá)組患者（P=0.039）。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)：全部AML中，BP1高表達(dá)組患者的總體生存（overall survival，OS）時間短于BP1低表達(dá)組患者，差異接近統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.067），在non-M3-AML和正常核型AML（cytogenetically normal AML，CN-AML）中，BP1高表達(dá)組患者的OS時間顯著短于BP1低表達(dá)組患者（

6、P=0.001和P=0.040）。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)：BP1高表達(dá)無論是在全部 AML還是 non-M3-AML中都是患者預(yù)后不良的獨立影響因素（P=0.020和P=0.014），在CN-AML中接近統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.054）。DLX7高、低表達(dá)組之間患者的全部臨床參數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），此外，兩組患者之間的CR率和OS時間也無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。AML患者和對照組DLX4啟動子1（BP1上游）區(qū)域CpG島呈現(xiàn)完全

7、未甲基化。然而，AML患者DLX4啟動子2（DLX7上游）區(qū)域CpG島甲基化（因DLX4啟動子1無異常甲基化，以下將DLX4啟動子2甲基化定義為DLX4甲基化）水平顯著高于對照組（P<0.001）。DLX4高、低甲基化組之間患者的性別、年齡、外周血三系計數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例、FAB分型、WHO分型、核型、核型分組及常見基因突變均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但DLX4高甲基化組患者中U2AF1突變率更高（P=0.043）。無論是全部AM

8、L還是non-M3-AML患者中，DLX4高甲基化組患者CR率顯著低于DLX4低甲基化組患者（P=0.001）。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)：無論是在全部AML、non-M3-AML還是CN-AML中，DLX4高甲基化組患者的OS時間顯著短于DLX4低甲基化組患者（P=0.003、P=0.001和P=0.032）。Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)：DLX4高甲基化患者在全部AML和non-M3-AML中是患者預(yù)后不良的獨立影響因素（P=0.00

9、1和P<0.001）。AML患者中DLX4甲基化水平和BP1表達(dá)水平無相關(guān)性（R=?0.049，P=0.582），然而，和DLX7表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（R=?0.202，P=0.021）。Kasumi-1和THP1細(xì)胞株經(jīng)過5-aza-dC處理后，DLX4甲基化水平下降，BP1和 DLX7表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05）。
　　CML患者DLX4甲基化水平顯著高于對照組（P=0.002），此外，CML急變期（CML in blast cr

10、isis，BC-CML）患者的甲基化水平顯著高于慢性期（CML in chronic phase，CP-CML）和加速期（CML in accelerated phase，AP-CML）患者（P<0.001）。DLX4高、低甲基化組患者的性別、年齡、外周血三系細(xì)胞計數(shù)和 BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。然而，DLX4高甲基化的比例在 BC-CML中最高（83％），CP-CML最低（26%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

11、（P=0.001）。此外， DLX4高甲基化在t(9;22)合并其他染色體患者中的比例顯著增高（P=0.010）。對2例發(fā)生疾病進展的CML患者檢測發(fā)現(xiàn)由慢性期和（或）加速期進入急變期后DLX4甲基化密度顯著增高（P<0.05）。CML患者中DLX4甲基化水平和BP1表達(dá)水平無相關(guān)性（R=0.134，P=0.244），然而，和DLX7表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（R=?0.382， P=0.001）。K562細(xì)胞株經(jīng)過5-aza-dC處理后，DLX

12、4甲基化水平下降，BP1和DLX7表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05）。
　　MDS患者DLX4甲基化水平顯著高于對照組（P<0.001），DLX4高、低甲基化組患者的年齡、性別、外周血三系細(xì)胞計數(shù)、FAB分型、IPSS分組、WHO分型和常見基因突變差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)： DLX4高甲基化組患者的OS時間顯著短于DLX4低甲基化組患者（P=0.004）。Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)：DLX4高甲基化

13、是MDS患者預(yù)后不良的獨立影響因素（P<0.001）。
　　結(jié)論：①DLX4兩個異構(gòu)體在AML患者中的表達(dá)態(tài)勢不同，BP1過表達(dá)是AML患者的常見分子事件且與AML患者預(yù)后不良相關(guān)，DLX7低表達(dá)是AML常見分子事件但與預(yù)后無關(guān)。②AML與CML患者中DLX4啟動子1區(qū)域甲基化態(tài)勢并無改變，但DLX4啟動子2區(qū)域發(fā)生高甲基化改變，并且跟DLX7表達(dá)負(fù)向關(guān)。③DLX4啟動子2區(qū)域甲基化與AML和MDS患者預(yù)后不良相關(guān)，與CML患者疾