JNK和ERK5在BMP9誘導(dǎo)C3H10T1-2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、第一部分經(jīng)BMP9誘導(dǎo)后C3H10T1/2細(xì)胞JNK和ERK5的激活情況
　　目的:檢測(cè)經(jīng)高滴度攜帶GFP和BMP9基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后JNK和ERK5的激活情況。
　　方法:培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，并用其對(duì)AdBMP9和AdGFP進(jìn)行擴(kuò)增，提高AdBMP9和AdGFP的滴度。高滴度AdBMP9和AdGFP轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞24h后，熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，免疫

2、熒光技術(shù)定位p-JNK和p-ERK5在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位，利用CCK-8檢測(cè)特異性抑制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響，Western blot檢測(cè)加入JNK或ERK5信號(hào)通路特異性抑制劑SP600125或BIX02189并轉(zhuǎn)染后JNK和ERK5的激活情況。
　　結(jié)果:1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)高滴度AdBMP9和AdGFP轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞24h后的轉(zhuǎn)染效率均可達(dá)50％左右。
　　2.倒置顯微鏡下觀察AdBMP9轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的形態(tài)隨培養(yǎng)

3、時(shí)間的延長(zhǎng)由多邊形逐漸向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變，且細(xì)胞間鏈接更加緊密。
　　3.免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示各組細(xì)胞的胞質(zhì)、胞核均可見(jiàn)p-JNK及p-ERK5的表達(dá)，但經(jīng)AdBMP9誘導(dǎo)后p-JNK及p-ERK5的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且表達(dá)主要分布于胞核及大部分靠近胞核的胞漿內(nèi)。
　　4.CCK-8結(jié)果顯示C3H10T1/2細(xì)胞的生存率均隨特異性抑制劑濃度的增高而降低，但是實(shí)驗(yàn)選擇的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于IC50，因此其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用可忽略不計(jì)。

4、　　5.Western blot結(jié)果顯示經(jīng)AdBMP9誘導(dǎo)后p-ERK5和p-JNK的表達(dá)均顯著增高，而表達(dá)又隨著特異性抑制劑濃度的升高逐漸降低。
　　結(jié)論:利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增得到的高滴度AdBMP9和AdGFP對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染后的C3H10T1/2細(xì)胞p-ERK5和p-JNK的表達(dá)均顯著增高，且表達(dá)情況又隨著抑制劑濃度的升高逐漸降低，15μmol/L BIX02189、20μmol/L SP6

5、00125可以阻斷經(jīng)AdBMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞ERK5及JNK的激活。
　　第二部分特異性阻斷JNK和ERK5后經(jīng)BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的情況
　　目的:經(jīng)AdBMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞在利用JNK特異性抑制劑SP600125和ERK5特異性抑制劑BIX02189阻斷后向心肌樣細(xì)胞分化的情況。
　　方法:利用15μmol/L BIX02189、20μmol/LSP6

6、00125阻斷ERK5及JNK的激活，RT-qPCR檢測(cè)經(jīng)AdBMP9誘導(dǎo)1周時(shí)C3H10T1/2細(xì)胞心肌特異性基因GATA4、MEF2C表達(dá)，Western blot檢測(cè)經(jīng)AdBMP9誘導(dǎo)3周時(shí)細(xì)胞心肌特異性蛋白cTnT和CX43表達(dá)，免疫熒光技術(shù)定位cTnT、CX43在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　結(jié)果:BIX02189抑制ERK5激活后，AdBMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的心肌分化標(biāo)志物MEF2C、GATA4、CX43、cTnT