CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞活化對其CCR5表達及趨化性影響的實驗研究.pdf

1、在移植免疫耐受機制的研究中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的作用越來越受到大家的重視。Tregs是一類高表達CD25和叉頭/翼形螺旋狀轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)的CD4+T細胞，具有很強的免疫抑制功能。在嚙齒類動物研究證明，輸注體外生成的Tregs可治愈結(jié)腸炎、自身免疫性糖尿病和腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病，控制移植物抗宿主病和移植排斥反應(yīng)。Bai等采用基因敲除粘附分子CD62L的表達，阻斷Tregs的在體歸巢特性，則移植免疫

2、耐受無法形成。在體使用CD62L抗體也可導(dǎo)致淋巴結(jié)中募集的Tregs 消失，出現(xiàn)移植物排斥反應(yīng)。而在阻斷CD62L的同時采用FTY720誘導(dǎo)CD62L 非依賴性的Tregs 歸巢能力則可恢復(fù)Tregs在淋巴結(jié)的聚集及移植物的耐受。
　　 上述研究顯示，在趨化性作用下Tregs 向淋巴結(jié)的歸巢對其發(fā)揮移植免疫耐受作用至關(guān)重要，趨化性改變有可能會干擾其在體狀態(tài)下的免疫抑制作用。
　　 雖然采用供體抗原活化可誘導(dǎo)Tregs 擴

3、增，擴增的Tregs在體外具有抗原特異性免疫抑制作用，但是Oliveira等采用體外擴增的Tregs 輸注治療未能誘導(dǎo)免疫耐受的形成。我們推測，活化后Tregs 趨化性改變有可能是導(dǎo)致其在體免疫耐受誘導(dǎo)失敗的主要原因。目前許多學(xué)者致力于研究體外擴增Tregs 再輸注誘導(dǎo)免疫耐受，而體外活化、擴增對Tregs 趨化性改變很少引起重視。闡明體外擴增的Tregs 趨化性改變直接影響其進入體內(nèi)后遷移轉(zhuǎn)運過程，也給合理設(shè)計應(yīng)用Tregs細胞輸注治

4、療提供有價值的依據(jù)。
　　 T細胞的增殖分為穩(wěn)態(tài)增殖和活化后增殖兩種類型。穩(wěn)態(tài)增殖是指在沒有特異性抗原刺激活化的狀態(tài)下細胞的分裂擴增，有利于維持血液中的細胞數(shù)量。而活化后的增殖則存在特異性的抗原刺激和細胞由原有的幼稚或記憶狀態(tài)變?yōu)榛罨?。目前體外擴增多采用CD3、CD28抗體刺激進行非特異性擴增或采用負載抗原的APC 刺激擴增，兩種方式均為活化后擴增，而活化過程可能會導(dǎo)致趨化性的改變。
　　 趨化因子受體的表達是Tregs

5、 進行靶向遷移、在特定部位發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Tregs 可表達CXCR4、CCR4、CCR5、CCR8、E/P-selectin、CD103、CD62L、CCR7、CXCR5等多種趨化因子受體和粘附分子。CCR5是趨化蛋白MIP-1α，MIP-1β、RANTES的特異性受體，主要表達于單核/巨噬細胞及T細胞膜上，具有G蛋白受體所特有的7個跨膜區(qū)。已有研究表明：CCR5在Tregs的表達是介導(dǎo)母胎耐受的形成、移植物抗宿主病的控制

6、、慢性感染的形成、腫瘤對免疫監(jiān)控的逃逸等生理及病理反應(yīng)的關(guān)鍵趨化蛋白受體。但是CCR5基因多態(tài)性研究表明，CCR5Δ32是無活性的受體，在白種人中占1％，CCR5Δ32 純合子受者的移植腎存活期顯著延長，進一步表明CCR5在移植免疫中具有重要作用。目前尚無動物模型證實CCR5在誘導(dǎo)移植免疫耐受中的作用，本實驗采用CD3/CD28抗體包被磁珠體外活化、擴增Tregs細胞，闡明體外活化的Tregs上CCR5的表達和Tregs 功能的變化，以

7、及這種變化對免疫耐受形成的可能影響。
　　 現(xiàn)將本課題主要實驗方法、實驗結(jié)果和結(jié)論總結(jié)如下：
　　 一、小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的分離、擴增及鑒定取清潔級C57BL/6小鼠4只，制備小鼠脾細胞懸液，細胞總數(shù)大于2×108 可進行下步MACS分選。按小鼠CD4+CD25+T細胞分選試劑盒說明書分選CD4+CD25+T細胞，同時得到CD4+CD25-T細胞，作為效應(yīng)性T細胞。將獲得的細胞經(jīng)臺盼藍染色檢測細胞的活力；

8、流式細胞儀檢測細胞的純度和細胞表型；3H-TdR 摻入法檢測該細胞對CD4+CD25-T細胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示所得細胞活力為(95. 1±1.6)％，純度為97.36％，胞內(nèi)因子Foxp3在Tregs細胞的表達率為73.96％，和Tregs 混合培養(yǎng)的Teff組cpm值明顯低于對照組，Tregs 存在(Tregs：Teff=1：1)的情況下Teff 增殖cpm值(3H-TdR 摻入率3615.78±109.56)較對照組顯著性降低

9、，p＜0.01。按“雷帕霉素(RAPA)+rIL-2+CD3/CD28”方案體外擴增Tregs3周。流式細胞儀檢測擴增后的Tregs細胞表型；3H-TdR 摻入法檢測Tregs 抑制功能。結(jié)果顯示，經(jīng)3周擴增后Tregs 可達(105±21)倍數(shù)。擴增的Tregs 仍具有典型的CD4+CD25+Foxp3+表型特征和較強的免疫抑制功能。
　　 二、小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞活化后CCR5的表達1．采用CD3/CD28抗體

10、包被磁珠，磁珠/細胞為1：1，鼠重組白細胞介素終濃度300U/ml，分別誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細胞及 CD4+CD25-細胞，于5％CO2飽和濕度、37 ℃孵箱分別培養(yǎng) 0、2、4天后收集細胞。流式細胞儀檢測該細胞的CCR5 膜表達；3H-TdR 摻入法檢測該細胞對CD4+CD25-T細胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，CD4+CD25+T細胞CCR5表達隨活化時間延長逐漸增強。經(jīng)CD3/CD28抗體包被磁珠活化4天后的CD4+CD

11、25+T細胞可明顯抑制效應(yīng)性T細胞的增殖，且當(dāng)兩者比例為1∶
　　 1時抑制能力最強，抑制率為88.4％。
　　 2．分別于Transwell下室即24孔板中加入600μL 趨化因子CCL5 工作液及BM液對照。將誘導(dǎo) 0、 2、 4d的CD4+CD25+T細胞及CD4+CD25-T細胞用 BM 液調(diào)整為終濃度5×105 ml-1，分別加入100μL細胞懸液于 Transwell上室中。5％ CO2、37 ℃
　　

12、 環(huán)境下孵育4h，混勻下室細胞，計數(shù)進入下室細胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，CCL5對活化后的調(diào)節(jié)性T細胞趨化作用強于新鮮分離的CD4+CD25+T細胞，兩者相比差異顯著。
　　 同一時間點，CCL5對CD4+CD25+T細胞趨化作用弱于CD4+CD25-T細胞。
　　 三、在體觀察Tregs在移植物局部微環(huán)境的分布為了明確體外活化擴增的Tregs 輸注治療后在體狀態(tài)下的趨化特性改變，我們采用“套管法”建立小鼠同種異體頸部異位心

13、臟移植模型(BALB/c 供體，C57BL/6 受體)。
　　 分4組：A組(n=6)，圍手術(shù)期未給予任何免疫抑制治療。B組(n=6)，術(shù)后3天經(jīng)小鼠尾靜脈輸入擴增后的Tregs，2×106個。C組(n=6)，術(shù)后給予腹腔注射RAPA 1mg/kg-1體重/天，共注射2周。D組(n=6)，同系移植，即供、受體均采用BALB/c小鼠，術(shù)后3天經(jīng)小鼠尾靜脈輸入擴增后的Tregs2×106個。根據(jù)心臟搏動情況判斷移植物功能，完全停跳為

14、排斥反應(yīng)，存活大于100天為耐受。移植術(shù)后第7天，每組中任取2只小鼠，斷頸處死，Western blotting 測定心臟移植物Foxp3的表達，免疫組化方法測CCR5在移植物局部的表達。結(jié)果顯示：Tregs細胞輸注治療(B組)明顯延遲了移植物急性排斥反應(yīng)的發(fā)生時間，心臟移植物存活(26.00±3.03)天。Tregs細胞輸注治療后，F(xiàn)oxp3蛋白在急性排斥反應(yīng)的移植心臟中(B組)表達較同系移植組(D組)明顯增多。
　　 結(jié)論：

15、
　　 一、利用MACS分選系統(tǒng)能夠從小鼠脾臟單個核細胞中分離出純度超過90％的CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25-T細胞，分選所得細胞具有較強活性和功能，滿足后續(xù)實驗的要求。
　　 二、采用“RAPA+rIL-2+CD3/CD28抗體包被磁珠”方案擴增后的Tregs 仍具有典型的CD4+CD25+Foxp3+表型特征，保持較強的活性和免疫抑制功能。
　　 三、CD4+CD25+T細胞活化后CCR5表達較