臍帶血多能成體祖細(xì)胞生物學(xué)特性及分離相關(guān)影響因素的研究.pdf

1、本課題探討臍帶血中多潛能成體祖細(xì)胞(MAPCs)的分離方法，優(yōu)化MAPCs的培養(yǎng)條件。在此基礎(chǔ)上研究MAPCs的生物學(xué)特性以及臍帶血MAPCs的神經(jīng)分化潛能，為今后將其應(yīng)用于臨床提供相關(guān)的基礎(chǔ)理論和方法。 一、低血清條件下影響臍帶血MAPCs分離的相關(guān)因素利用足月妊娠健康產(chǎn)婦胎兒新鮮臍帶血，分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，在低血清條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過比較不同培養(yǎng)基、不同接種密度以及不同的首次換液時(shí)間對臍帶血MAPCs生長的影

2、響，研究低血清條件下從臍帶血中分離MAPC的相關(guān)影響因素，探索優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立臍帶血MAPCs的分離培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，在低血清條件下，DMEM/F12培養(yǎng)基更適合于臍帶血MAPC生長；1×106/cm2是原代培養(yǎng)的適宜接種密度，原代第72小時(shí)首次換液為最佳換液時(shí)問。臍帶血的質(zhì)量可能是影響分離效果的因素之一。利用所建立的人臍帶血MAPCs的體外優(yōu)化培養(yǎng)條件培養(yǎng)的細(xì)胞可于超過70％的臍帶血中分離出MAPCs并在體外持續(xù)擴(kuò)增，并具有良好的

3、分化潛能。 二、MAPCs的生物學(xué)特性以及臍帶血MAPCs的神經(jīng)分化潛能利用第一部分所建立的分離和培養(yǎng)體系，從新鮮臍帶血中分離臍帶血MAPCs，觀察細(xì)胞生長特點(diǎn)、生長曲線、細(xì)胞周期、細(xì)胞表型分析、體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)以及檢測其細(xì)胞因子的表達(dá)等。結(jié)果表明，73％的臍帶血標(biāo)本可以分離出MAPCs，細(xì)胞形態(tài)為長梭狀，類似于成纖維細(xì)胞，90％以上細(xì)胞處于G0/G1期，可以傳至8-10代以上而無形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞表面標(biāo)志檢測發(fā)現(xiàn)MAPCs高表達(dá)

4、常用于識(shí)別人間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記CD29、CD44、CD90以及CD73、CD105等，低表達(dá)CD144、vWF和CD49d，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45，CD14，CD3、HLA-DR、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31和整合素CD11a，具有與臍帶血來源MSC和USSCs類似的細(xì)胞免疫表型特征，而與PSC3445細(xì)胞存在明顯差別。MAPCs在一定的誘導(dǎo)分化劑的作用下可向神經(jīng)細(xì)胞、成骨和脂肪細(xì)胞分化，并能表達(dá)IL-6、SCF、FL和G-C