載基因固體脂質(zhì)納米粒的研究.pdf

1、本文以硬脂酸(或AT0888)和卵磷脂為脂質(zhì)材料，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(pEGFP)作為報(bào)告基因，采用不同的工藝和組裝技術(shù)制備出三種不同的載基因固體脂質(zhì)納米粒。其一是：陽離子固體脂質(zhì)納米粒/pDNA二元復(fù)合物；其二是：陰離子型載魚精蛋白-pDNA復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒；其三是：陰離子型載pDNA固體脂質(zhì)三元復(fù)合納米粒。課題主要研究方法與結(jié)果如下： 1.模型基因的選擇和制備本研究中我們利用微生物發(fā)酵的方法大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的大腸

2、桿菌，并采用柱層析的方法分離純化質(zhì)粒。紫外分光光度法對(duì)質(zhì)粒的純度和含量進(jìn)行了測(cè)定，凝膠電泳法對(duì)質(zhì)粒的單酶切結(jié)果進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示質(zhì)粒純度符合要求。 2.陽離子固體脂質(zhì)納米粒/pDNA二元復(fù)合物的研究本研究中我們制備陽離子固體脂質(zhì)納米粒替代傳統(tǒng)的陽離子脂質(zhì)體，以克服后者穩(wěn)定性不佳的問題。文中以CTAB為表面活性劑采用復(fù)乳法制備空白陽離子固體脂質(zhì)納米粒，與報(bào)告基因復(fù)合，加入不同濃度Ca2+調(diào)節(jié)體系的荷正電量。最終得到的SLNs-p

3、DNA二元復(fù)合物的平均粒徑為(91.6±5.3)nm，粒徑分布均勻，細(xì)胞平均存活率相對(duì)于陰性對(duì)照組均在80％到110％之間，在生理酶濃度條件下，載體具有較好的保護(hù)pDNA抗核酸酶降解的能力。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SLNs-pDNA二元復(fù)合物釋藥符合Weibull模型：lnln[1/(100-R/100)]=-0.44821nt+0.1329，r=0.9926。據(jù)此可以預(yù)計(jì)，DNA在陽離子固體脂質(zhì)納米粒的保護(hù)下，能夠維持較長(zhǎng)的作用時(shí)間。體

4、外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與裸露DNA相比，SLNs-pDNA在COS-7中的轉(zhuǎn)染效果顯著提高。在24h時(shí)復(fù)合物的轉(zhuǎn)染能力較陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine低，到48h時(shí)細(xì)胞中的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，蛋白表達(dá)率顯著提高較Lipofectamine組有所加強(qiáng)。 3.陰離子型載魚精蛋白-pDNA復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒的研究鑒于陽離子型基因載體存在血液循環(huán)中穩(wěn)定性差及給藥途徑單一等不足之處，我們考慮制備適合全身給藥的陰離子型固體脂質(zhì)納米

5、粒。文中采用陽離子聚合物--魚精蛋白縮合pDNA形成致密復(fù)合物，提高裸pDNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而將該復(fù)合物利用脂質(zhì)材料進(jìn)行包裹。其體外抗剪切實(shí)驗(yàn)，抗酶解實(shí)驗(yàn)和釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果都能夠與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的初衷相吻合。本文中對(duì)陰離子型固體脂質(zhì)納米粒作為基因載體的研究是一個(gè)全新的嘗試，在制備包封型固體脂質(zhì)納米粒時(shí)發(fā)現(xiàn)，最終產(chǎn)品的粒徑較大，包封率為(86.5±5.28)％，粒徑為(627±22.9)nm；控制粒徑則不能夠得到理想的包封率，粒徑為(231±13.7

6、)nm時(shí)，包封率僅為(41.5±3.62)％，從而不能達(dá)到進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的要求，為此我們?cè)噲D通過靜電吸附的方法組裝新型的載基因納米粒，從而彌補(bǔ)包封型固體脂質(zhì)納米粒的不足。 4.陰離子型載pDNA固體脂質(zhì)三元復(fù)合納米粒的研究在包封型載pDNA固體脂質(zhì)納米粒的研究結(jié)果不盡如人意的同時(shí)，本文采用固體脂質(zhì)三元復(fù)合納米粒的全新思路對(duì)陰離子型載基因固體脂質(zhì)納米粒的研究予以補(bǔ)充和完善。采用薄膜分散．超聲法制備出平均粒徑為(19.2±5.5)

7、nm的陰離子型空白固體脂質(zhì)納米粒，在靜電作用下將其自組裝到平均粒徑為(165±28.1)nm的正電性魚精蛋白-pDNA二元復(fù)合物表面，最終形成平均粒徑為(257.7±10.6)nm，zeta電位為(-17.16±1.92)mV的三元復(fù)合納米粒，其結(jié)合率達(dá)到(96.75±1.13)％。TEM和CD實(shí)驗(yàn)結(jié)果均驗(yàn)證了三元復(fù)合納米粒的形成。體外抗酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二元復(fù)合物和三元復(fù)合納米粒中完整DNA的回收率分別為60％和85％，降解率具有顯著

8、性差異(p<0.05)。體外釋放實(shí)驗(yàn)在PBS中進(jìn)行，三元復(fù)合納米粒的釋放過程符合Ritger-Peppas方程：lnR=0.6038 lnt+1.5292(r=0.9942)，有明顯的體外緩釋能力。與二元復(fù)合物相比，48h內(nèi)三元復(fù)合納米粒的細(xì)胞成活率較前者高(P<0.05)，并且明顯低于陽性對(duì)照(Lipofectamine組)的細(xì)胞毒性。體外基因轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，48h的轉(zhuǎn)染量接近Lipofectamine組，高于二元復(fù)合物組。 綜