鉤端螺旋體腺苷甲硫氨酸依賴型氧甲基化酶和人線粒體外膜蛋白mitoNEET的結(jié)構(gòu)生物學研究.pdf

1、第一部分鉤端螺旋體腺苷甲硫氨酸依賴型氧甲基化酶的晶體學研究 對所有的生物而言，甲基化是一個重要而又普遍存在的生物學過程。絕大部分的甲基化酶采用腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，甲基化完成后腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為腺苷高胱氨酸。在致病性細菌問號型鉤端螺旋體全基因組測序完成后，基因LA0415的產(chǎn)物被注釋為腺苷甲硫氨酸依賴型氧甲基化酶(LiOMT)。經(jīng)序列分析LiOMT被歸為Methyltransf_3蛋白家族(Pfam PF01593)，在這個

2、家族中細菌來源的所有已知功能的5個甲基化酶均被報道參與抗生素合成。我們用大腸桿菌大量表達了LiOMT并得到晶體。在晶體結(jié)構(gòu)中LiOMT結(jié)合有腺苷高胱氨酸配基，展示出非常保守的腺苷甲硫氨酸(腺苷高胱氨酸)結(jié)合區(qū)域和獨特的金屬離子依賴的催化區(qū)域。LiOMT分子通過N端的交換形成同二聚體，據(jù)文獻報道這種二聚的形式能夠在沒有底物結(jié)合的情況下促進底物結(jié)合區(qū)預折疊。LiOMT的催化區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域的一級序列和三維結(jié)構(gòu)預示它的底物是一種酚類化合物，

3、這種酚類化合物可能帶有一個大環(huán)形狀的尾巴。這是Methyltransf_3家族中的第一個細菌來源的結(jié)構(gòu)，LiOMT晶體結(jié)構(gòu)也給這個家族中其他細菌來源的抗生素合成相關(guān)蛋白提供了可供參考的結(jié)構(gòu)信息。 第二部分人線粒體外膜蛋白mitoNEET的晶體學研究 mitoNEET是新近被發(fā)現(xiàn)的線粒體外膜蛋白，它能夠特異性結(jié)合抗Ⅱ型糖尿病的藥物吡格列酮。我們對mitoNEET的細胞質(zhì)可溶部分(mitoNEET<,33-108>)進行了結(jié)

4、構(gòu)解析。mitoNEET<,33-108>擁有一個全新的折疊類型，并含有一個[2Fe-2S]鐵硫中心。這個鐵硫中心與mitoNEET<,33-108>的Cys72，Cys74，Cys83和His87配位，相對于已知的4個Cys配位和2個Cys、2個His配位的[2Fe-2S]鐵硫中心來說，這種3個Cys、1個His的配位類型也是在自然界中第一次發(fā)現(xiàn)。mitoNEET<,33-108>在溶液中和在晶體結(jié)構(gòu)中都形成同二聚體，兩個單體通過界面

5、間的疏水相互作用以及兩個水分子介導的氫鍵相互作用結(jié)合在一起。與[2Fe-2S]鐵硫中心配位的His-87暴露在二體的表面，對鐵硫中心的功能起著重要作用。我們推測mitoNEET在線粒體外膜上形成二體，并通過二體表面上靠近[2Fe-2S]鐵硫中心的區(qū)域與其它蛋白相互作用。 第三部分大腸桿菌膜蛋白二酯酰甘油激酶的初步晶體學研究 大腸桿菌膜蛋白二酯酰甘油激酶(DAGK)是一個分子量為13 kDa的小蛋白，它能催化脂分子二酯酰甘

6、油(DAG)和MgATP磷酸化反應(yīng)生成另一種脂分子卵磷脂(PA)和MgADP。它在膜上形成三體，每個單體三次跨膜，很可能三個單體共同參與磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。大腸桿菌DAGK代表了一類微生物DAGK，它們與其它所有已知的DAGK都沒有序列同源性，卻和其它DAGK一樣催化復雜的磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。得到大腸桿菌的晶體結(jié)構(gòu)有利于我們了解這類獨特的激酶的分子機理。我們對DAGK進行了表達、純化和晶體篩選，目前已經(jīng)得到可以衍射的晶體，衍射分辨率為20 A的衍射