Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)CGI-2調(diào)控基因表達(dá)的研究.pdf

1、Dlk1-Dio3印記基因簇位于小鼠的第十二號(hào)染色體末端（12qF1），以及人類的第14號(hào)染色體上(14q32)。該印記區(qū)域?qū)ε咛ズ吞ケP的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要的調(diào)控作用，還影響成體的新陳代謝和大腦的功能。且該區(qū)域內(nèi)各基因表達(dá)在生長(zhǎng)發(fā)育中呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。CGI-2位于該區(qū)域內(nèi)miR-341和miR-1188附近，為該區(qū)域內(nèi)首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的母本甲基化而父本非甲基化的差異甲基化區(qū)域，且為結(jié)合CTCF并具有絕緣子活性的DNA功能原件。因此，本文

2、選取Dlk1-Dio3印記區(qū)域?yàn)檠芯繉?duì)象，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)CGI-2進(jìn)行長(zhǎng)片段的基因組刪除，在細(xì)胞水平上分析CGI-2敲除后其上下游基因的表達(dá)變化。
　　首先，本文對(duì)細(xì)胞系內(nèi)Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，從而篩選出三株適合敲除實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系。所選擇的三株細(xì)胞系分別為Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平偏高的N2a、該印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平較低的Hepa1-6以及非癌細(xì)胞系NIH3

3、T3。通過(guò)向?qū)NA預(yù)測(cè)網(wǎng)站設(shè)計(jì)出用于CRISPR/Cas9敲除實(shí)驗(yàn)的兩對(duì)向?qū)NA，并且構(gòu)建px330重組質(zhì)粒。
　　其次，在N2a細(xì)胞中進(jìn)行CGI-2敲除預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇適合用于實(shí)驗(yàn)的向?qū)NA。隨后，分別在N2a、Hepa1-6和NIH3T3三種細(xì)胞系中進(jìn)行CGI-2的CRISPR/Cas9的基因敲除，在驗(yàn)證敲除成功的前提下通過(guò)實(shí)時(shí)定量分析的方法判斷在CGI-2缺失的情況下Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)父母本基因的表達(dá)水平變化。其

4、結(jié)果顯示，敲除位點(diǎn)遠(yuǎn)端的Dio3并沒(méi)有明顯的變化、Dlk1有不顯著的下調(diào)趨勢(shì)；位于次遠(yuǎn)端的Mirg呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)，但在不同細(xì)胞系中其上調(diào)程度存在差異；而位于區(qū)域中間部分的Gtl2、Rtl1、Rian、Meg8、Irm和AB063319有顯著的上調(diào)趨勢(shì)。綜上可知，CGI-2的缺失會(huì)導(dǎo)致Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達(dá)水平的變化，即CGI-2對(duì)該印記區(qū)域的表達(dá)具有調(diào)控作用。
　　最后，檢驗(yàn)在刪除CGI-2和未刪除CGI-2的兩

5、種情況下Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)Dlk1-DMR、Gtl2-DMR、IG-DMR和CGI-1-DMR這四個(gè)差異甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，在刪除CGI-2和未刪除CGI-2的兩種情況這四個(gè)差異甲基化區(qū)域均為高甲基化狀態(tài)，即未發(fā)生改變。
　　綜上所述，CGI-2的缺失會(huì)導(dǎo)致其所在的Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)多種基因表達(dá)水平發(fā)生變化，且這種變化趨勢(shì)在不同細(xì)胞系中大致相同；CGI-2對(duì)該印記區(qū)域中基因表達(dá)的調(diào)控作用與該區(qū)域內(nèi)