輔助生殖技術(shù)子代胎盤中生長發(fā)育相關(guān)印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的表達(dá)和基因印記研究.pdf

1、自1978年首例試管嬰兒誕生以來，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductivetechnology,ART)用于臨床已逾30年，為不孕癥的治療作出了巨大的貢獻(xiàn)。目前，發(fā)達(dá)國家1-4％的新生兒來自ART，隨著子代生育高峰的到來，ART子代已逐漸成為世界人口的重要組成部分。ART非自然生殖的特性以及缺乏臨床前安全性研究而直接臨床應(yīng)用的背景，日益引起人們對其生殖遺傳安全性的關(guān)注。雖然目前未發(fā)現(xiàn)ART可直接導(dǎo)致子代出現(xiàn)明顯畸形，但不

2、斷有報道指出，ART子代不良健康風(fēng)險增加，生長發(fā)育問題就是其中之一，胎兒過度生長或低出生體重兒的風(fēng)險增高，但原因尚不明確?？赡茉从诓辉蟹驄D自身的遺傳背景，也可能與ART的一系列操作相關(guān)。
　　 表觀遺傳學(xué)是近年來在國際上迅猛發(fā)展的嶄新研究領(lǐng)域，它是指通過DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾等不改變基因核苷酸序列的方式，將遺傳信息傳遞給子代的過程，包括DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾等。其中，基因印記使某些基因（印記基因）在個體中只

3、有一個親本來源的等位基因表達(dá)。印記基因在人類基因組中只占少數(shù)，但在生長發(fā)育過程中卻發(fā)揮至關(guān)重要的作用，一旦出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致印記疾病或腫瘤的發(fā)生?；蚪M的印記修飾是可逆的，易受環(huán)境因素的干擾而出現(xiàn)可遺傳的改變，影響子代表型。基因印記在配子及胚胎發(fā)育早期需經(jīng)歷擦除及重建過程，ART恰施于這一表觀遺傳修飾重編程的關(guān)鍵時期。近年來已有大量研究發(fā)現(xiàn)，ART操作可導(dǎo)致印記基因表達(dá)、DNA甲基化修飾等改變。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ART子代患罕見印記異常疾

4、病，如Beckwith-Wiedemann綜合征的風(fēng)險增加。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)，ART子代臍血中印記基因表達(dá)、印記狀態(tài)及甲基化狀態(tài)異常。因此，ART極有可能通過干擾基因印記而影響子代生長發(fā)育潛能。
　　 在胚胎期，滋養(yǎng)層細(xì)胞較內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對環(huán)境因素的干擾更為敏感，因此胎盤組織發(fā)生表觀遺傳修飾異常的風(fēng)險比胎兒更大。在胎盤中有許多參與母胎間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、影響胎盤、胎兒生長的印記基因表達(dá)。其中，父源表達(dá)（母源印記）的印記基因促進(jìn)胎兒生長

5、和營養(yǎng)吸收；母源表達(dá)（父源印記）的印記基因抑制胎兒生長。這些基因的缺失或異常激活均可導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育異常。
　　 ART是否可通過干擾胎盤基因印記而影響子代的生長發(fā)育？其干擾的程度如何？相關(guān)機(jī)制如何？至今不明。
　　 本研究以人類ART及自然妊娠足月、單胎子代的胎盤組織為研究對象，選擇其中父源印記的生長抑制基因CDKN1C（cyclin-dependent kinase inhibitor1C）、PHLDA2（pleck

6、strin homology-like domain,family A，member2）及母源印記的生長促進(jìn)基因IGF2(insulin-like growth factor2)，用逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcripTiO2，RT)-實時熒光定量PCR(Real time PCR)、蛋白印跡(Westemblot)、PCR直接測序、RT-PCR直接測序、PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳、亞硫酸鹽測序(bisulfite sequenc

7、ing,BSP)等方法研究其表達(dá)、甲基化狀態(tài)及印記狀態(tài)，探索ART影響子代生長發(fā)育的表觀遺傳機(jī)制，評估ART的生殖遺傳安全性。
　　 第一部分 ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的表達(dá)差異
　　 目的：研究ART子代胎盤中生長發(fā)育相關(guān)印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2表達(dá)與自然妊娠子代是否存在差異，并探索其與表型間的聯(lián)系。
　　 方法：收集足月、單胎ART子代胎盤39例，自然妊

8、娠子代胎盤40例，比較兩組新生兒出生體重。采用實時熒光定量PCR檢測胎盤中目的基因mRNA表達(dá)水平；采用蛋白印跡檢測蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：ART組新生兒平均出生體重低于對照組，但無顯著性差異。ART組胎盤中，CDKN1C、IGF2 mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，PHLDA2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)；PHLDA2 mRNA及CDKN1C、IGF2蛋白表達(dá)水平無顯著改變。
　　 結(jié)論：ART子代胎盤中存在生長發(fā)育相關(guān)印記基因

9、表達(dá)異常，可能影響子代的生長發(fā)育潛能。
　　 第二部分 ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2印記調(diào)控區(qū)和啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)研究
　　 目的：研究ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2印記調(diào)控區(qū)及啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)，比較其與自然妊娠子代間的差異，并探索其與基因表達(dá)間的關(guān)系。
　　 方法：選擇6例ART足月、單胎子代及5例自然妊娠足月、單胎子代胎盤，用亞硫

10、酸鹽測序法檢測目的基因印記調(diào)控區(qū) KvDMR1、H19 DMR及CDKN1C、PHLDA2啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：對照組印記調(diào)控區(qū)KvDMR1、H19 DMR均呈差異甲基化，甲基化率在50％左右。ART組KvDMR1區(qū)31個CpG位點(diǎn)的甲基化率均低于對照組，第9位點(diǎn)甲基化率顯著下降，其中一例ICSI子代甲基化率明顯低于對照組及其他ART標(biāo)本；H19 DMR區(qū)20個CpG位點(diǎn)的甲基化率普遍高于對照組，第7

11、位點(diǎn)甲基化率顯著上升，其中一例IVF子代甲基化率明顯高于對照組及其他ART標(biāo)本。對照組及ART組CDKN1C、PHLDA2啟動子區(qū)均呈低甲基化，甲基化率在0-23％左右。ART組CDKN1C啟動子區(qū)15個CpG位點(diǎn)中，第7-11位點(diǎn)甲基化率顯著下降；PHLDA2啟動子區(qū)23個CpG位點(diǎn)中，第5位點(diǎn)甲基化率顯著下降，第1、2、7、10、11位點(diǎn)甲基化率顯著上升。
　　 結(jié)論：ART子代胎盤印記基因的印記調(diào)控區(qū)及啟動子區(qū)DNA甲基化

12、狀態(tài)改變，提示ART可能通過干擾調(diào)控區(qū)的DNA甲基化而影響印記基因表達(dá)。
　　 第三部分 ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的印記狀態(tài)研究
　　 目的：研究ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的等位基因表達(dá)狀態(tài)及CDKN1C、IGF2的親源表達(dá)狀態(tài)，揭示它們在胎盤中的印記狀態(tài)是否改變，并探索印記狀態(tài)與印記調(diào)控區(qū)DNA甲基化改變及基因表達(dá)異常間的關(guān)系。
　　 方法：

13、以39例ART足月、單胎子代及40例自然妊娠足月、單胎子代胎盤為研究對象，用PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR直接測序、RT-PCR直接測序檢測胎盤中目的基因的印記狀態(tài)。
　　 結(jié)果：CDKN1C、PHLDA2及IGF2在胎盤中均為單等位基因表達(dá)的印記基因。CDKN1C為母源表達(dá)、父源印記基因，IGF2為父源表達(dá)、母源印記基因。在ART組未發(fā)現(xiàn)上述目的基因異常的印記狀態(tài)。
　　 結(jié)論：ART子代胎盤印記調(diào)控區(qū)及啟動子區(qū)D