人異常胎盤轉(zhuǎn)錄組分析及MAGEL2基因在豬胚胎中的印記研究.pdf

1、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和先兆子癇致病因素多樣，病情表現(xiàn)各異，目前關(guān)于它們的具體病理原因還不確定，但溯其根源，這兩種妊娠異常疾病都是由于胎盤機(jī)能不全造成的。目前已有一些報(bào)道的胎盤特異性生物化學(xué)標(biāo)記可用于鑒定先兆子癇，但這方面的信息還不全面，可用于臨床的生物標(biāo)記很少;而對(duì)于宮內(nèi)發(fā)育遲緩，由于該疾病病理的高異質(zhì)性、多樣性，以及與其他疾病同時(shí)發(fā)生等原因，傳統(tǒng)的臨床分類很難體現(xiàn)真實(shí)的病理分類信息，從而導(dǎo)致從基因組水平研究該疾病的分子機(jī)理存在一定困難。另一方

2、面，microRNA作為重要的基因表達(dá)調(diào)控元件，廣泛參與到很多胎盤發(fā)育相關(guān)的生物過程中（如細(xì)胞分化、增殖、凋亡、侵入及血管生成等），同時(shí)也可作為循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定的生物標(biāo)記。因此，本研究的目的是揭示人類胎盤的轉(zhuǎn)錄組，分析先兆子癇和宮內(nèi)發(fā)育遲緩中特異性的差異表達(dá)基因，根據(jù)差異表達(dá)基因篩選差異表達(dá)的microRNAs，作為預(yù)測(cè)先兆子癇和宮內(nèi)發(fā)育遲緩的分子標(biāo)記。為了實(shí)現(xiàn)此目的，本研究采用IlluminaHuman6.0BeadArray對(duì)86個(gè)人

3、類胎盤樣品的轉(zhuǎn)錄組展開研究，并綜合運(yùn)用可調(diào)模塊性聚類分析（ModulatedModularityClustering，MMC）和基因集合富集分析(GeneSetsEnrichmentAnalysis，GSEA)預(yù)測(cè)差異表達(dá)microRNAs，然后利用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證候選microRNAs在胎盤中的差異表達(dá)并構(gòu)建預(yù)測(cè)異常妊娠的決定樹，最后研究了microRNA作為分子標(biāo)記在母體血漿中的穩(wěn)定性。主要結(jié)果如下:
　　 (1)根據(jù)原始

4、臨床分類信息，從先兆子癇中鑒定到128個(gè)基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上表達(dá)差異顯著，2109個(gè)基因在FDR＜0.05水平上表達(dá)差異顯著;而在宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎盤中，僅能鑒定到1個(gè)基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上差異顯著，26個(gè)基因在FDR＜0.05水平上差異顯著，說明宮內(nèi)發(fā)育遲緩樣品存在高異質(zhì)性。
　　 (2)通過可調(diào)模塊性聚類分析(MMC)，鑒定到兩個(gè)分別代表宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)和先兆子癇

5、(PE)的模塊，它們分別是模塊3和模塊5。其中模塊3僅由IUGR胎盤組成，模塊5由11個(gè)PE和7個(gè)IUGR胎盤共同組成，且其中7個(gè)IUGR胎盤中有4個(gè)同時(shí)被診斷為PE，由此可以看出，模塊3代表IUGR，而模塊5代表PE。
　　 (3)根據(jù)由MMC獲得的新分組信息進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，從代表先兆子癇的模塊5中鑒定到889個(gè)基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上表達(dá)差異顯著，5184個(gè)基因在FDR＜0.05水平上表達(dá)差異

6、顯著;而從代表宮內(nèi)發(fā)育遲緩的模塊3中鑒定到326個(gè)基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上表達(dá)差異顯著，2100個(gè)基因在FDR＜0.05水平上表達(dá)差異顯著。
　　 (4)將異常胎盤內(nèi)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析，獲得的通路主要與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及發(fā)育相關(guān)。由模塊3中差異表達(dá)基因富集到的通路主要包括P13K、AKT、mTOR、eIF4、p70S6K信號(hào)通路，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，和IGF-1信號(hào)通路;由模塊5中差異表達(dá)基因富集到的

7、通路包括EIF2信號(hào)通路、RhoGDI信號(hào)通路，mTOR信號(hào)通路，以及與免疫反應(yīng)相關(guān)的通路，如白細(xì)胞外滲信號(hào)通路、Fcg受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬通路，以及CXCR4信號(hào)通路。
　　 (5)根據(jù)異常胎盤內(nèi)差異表達(dá)的分子標(biāo)簽，基因集合富集分析(GSEA)預(yù)測(cè)了差異表達(dá)的候選microRNA，選擇其中六個(gè)最顯著的microRNA(miR-520A-5p，miR-194，miR-412，miR-149，miR-483，miR-5

8、03)作為候選分子標(biāo)記。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，miR-194在先兆子癇(p=0.0001)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩(p=0.0304)胎盤中的表達(dá)水平都顯著下降，miR-149在先兆子癇(p=0.0168)中表達(dá)水平顯著下降。
　　 (6)根據(jù)6個(gè)候選microRNA在71個(gè)胎盤中的表達(dá)水平，分別構(gòu)建了預(yù)測(cè)先兆子癇和宮內(nèi)發(fā)育遲緩的決定樹。根據(jù)排列置換檢測(cè)，所得決定樹均在統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義顯著(p＜0.05)。
　　 (7)三個(gè)廣泛表達(dá)

9、的miRNAs（miR-16，miR-15，miR-24）在血漿中的水平保持恒定，不受室溫及反復(fù)凍融次數(shù)的影響;本研究中的差異表達(dá)miRNAs(miR-149，miR-194)在母本血漿中同樣非常穩(wěn)定，不受室溫及反復(fù)凍融次數(shù)的影響。說明組織釋放的microRNA穩(wěn)定地存在于外周循環(huán)血液中。
　　 另一方面，由于印記基因?qū)Σ溉閯?dòng)物胚胎發(fā)育和出生后的生長(zhǎng)發(fā)育都有重要作用，在人異常胎盤的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)很多印記基因的表達(dá)受到影響，而且影響

10、家畜數(shù)量性狀的一些基因同時(shí)存在印記現(xiàn)象，因此本研究另一目的是以豬為模式動(dòng)物，研究候選印記基因MAGEL2在兩個(gè)胚胎時(shí)期中的印記狀態(tài)以及該基因多態(tài)位點(diǎn)與豬胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析。主要結(jié)果如下:
　　 (1)豬MAGEL2基因與其人和小鼠中的同源基因一樣，為無(wú)內(nèi)含子基因。該基因主要在65日齡胚胎的腦、胎盤中高表達(dá)，其次是心臟，而在脾、肺、腎、胃、小腸和肌肉中的表達(dá)水平偏低，在肝中的表達(dá)水平最微弱。
　　 (2)豬MAGEL2基因

11、在65日齡胚胎所有被檢測(cè)組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、腦、胎盤）中均母本印記、父本表達(dá)，而在30日齡胚胎中存在印記多態(tài)性，即16個(gè)雜合子胚胎中有2個(gè)胚胎逃脫印記，說明在胚胎早期發(fā)育階段穩(wěn)定的印記還未建立完善。
　　 (3)大白×梅山F2代資源家系中的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，豬MAGEL2基因的多態(tài)位點(diǎn)g.2592A＞C與屠宰率和臀部背膘厚顯著相關(guān)(p＜0.05)，g.3277T＞C與骨率顯著相關(guān)(p＜0.05)，他們可能成為