2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、論文分為二章:
   第一章:小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞過程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達(dá)研究
   目的:體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞,觀察誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c印記變化,探討胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。
   方法:
   1.從孕小鼠胚胎分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,絲裂霉素C處理第3-5代小

2、鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備飼養(yǎng)層細(xì)胞,在飼養(yǎng)層細(xì)胞上擴(kuò)增培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞株SF1-G細(xì)胞。
   2.參照Shi等人的三階段法,定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G向胰島樣細(xì)胞分化;細(xì)胞免疫熒光染色和RT-PCR檢測分化細(xì)胞中胰島細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。
   3.在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的不同階段收集細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)/限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RT-PCR/RFLP)檢測印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達(dá)的親本來源,分析

3、其印記狀態(tài)。
   結(jié)果:
   1.SF1-G細(xì)胞能在飼養(yǎng)層細(xì)胞上保持未分化狀態(tài)增殖培養(yǎng)。
   2.RT-PCR結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)分化的第三階段,細(xì)胞逐漸出現(xiàn)胰島細(xì)胞特異性基因的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,分化終末細(xì)胞可表達(dá)胰島細(xì)胞特異性激素蛋白,證實(shí)成功將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞。
   3.RT-PCR/RFLP分析結(jié)果顯示,誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞印記基因Kcnq1、Cdkn1c從母源單等位基因表達(dá)

4、轉(zhuǎn)變成雙等位基因表達(dá),出現(xiàn)印記丟失(LOI),而持續(xù)傳代培養(yǎng)的ES細(xì)胞中Kcnq1、Cdkn1c仍表現(xiàn)為母源單等位基因表達(dá),即印記保持(MOI)。
   結(jié)論:
   1.參照Shi等人的方法,我們能將小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為胰島樣細(xì)胞。
   2.是誘導(dǎo)分化培養(yǎng)作用,而不是單純的細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程導(dǎo)致印記基因表達(dá)異常,出現(xiàn)印記丟失,即細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程導(dǎo)致了表觀遺傳性狀的不穩(wěn)定。
   第二

5、章:小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞過程中KνDMR1甲基化及Dmnt表達(dá)研究
   目的:觀察胚胎干細(xì)胞SF1-G在誘導(dǎo)分化前后印記基因Kcnq1、Cdkn1c印記調(diào)控區(qū)(ICR)差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1的甲基化狀態(tài),以及分化各階段細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平變化,以探討胚胎干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達(dá)變化的機(jī)理。
   方法:
   1.重亞硫酸鹽P

6、CR測序法檢測分化前后Kcnq1、Cdkn1c基因印記調(diào)控區(qū)KνDMR1的CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài):1)收集未分化的細(xì)胞及誘導(dǎo)分化終末的細(xì)胞,提取基因組DNA,重亞硫酸鹽處理DNA,以特異性引物PCR擴(kuò)增差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1;2)將PCR產(chǎn)物連接到氨芐抗性T載體質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌,用不含氨芐的LB培養(yǎng)基搖菌后均勻涂在氨芐瓊脂糖平板上,次日挑取陽性細(xì)菌克隆,用含氨芐的LB培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)菌;3)PCR驗(yàn)證細(xì)菌中存在目的片段后,將

7、菌液送送上海生工生物工程公司測序,測序結(jié)果通過軟件進(jìn)行分析,了解分化前后細(xì)胞的KνDMR1的甲基化狀態(tài)。
   2.Westernblot檢測誘導(dǎo)分化各階段細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1和Dmnt3b的表達(dá)水平。
   結(jié)果:
   1.測序檢測了KνDMRl區(qū)23個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),在分化前的胚胎干細(xì)胞中,9個測序結(jié)果顯示,有4個表現(xiàn)為1-23個CpG位點(diǎn)全部甲基化,另外5個表現(xiàn)為所有CpG位點(diǎn)都未甲基

8、化,即KνDMR1區(qū)的CpG位點(diǎn)表現(xiàn)為全甲基化或全未甲基化,符合印記調(diào)控區(qū)域差異性DNA甲基化區(qū)(DMR)的特點(diǎn);而在分化后的細(xì)胞中,11個測序結(jié)果顯示,其中5個表現(xiàn)為1-23個CpG位點(diǎn)全部甲基化,4個在第18-23個CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化,而其余CpG位點(diǎn)未甲基化,其余2個表現(xiàn)為所有CpG位點(diǎn)都未甲基化,提示原來未甲基化的KνDMR1發(fā)生了甲基化。
   2.Westernblot結(jié)果顯示,胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,從第二階段開始

9、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1水平顯著升高;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt3b在第三階段也顯著升高,而同期傳代培養(yǎng)的未分化細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平?jīng)]有明顯變化。
   結(jié)論:
   1.誘導(dǎo)分化過程中印記調(diào)控區(qū)域的差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1的第18-23個CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的改變可能與印記基因Kcnq1、Cdkn1c的印記丟失相關(guān)。
   2.誘導(dǎo)分化過程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平升高,可能介導(dǎo)了KνDMR1區(qū)甲基化狀

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