海蛇蛇毒抗炎活性肽Hydrostatin--SN10的靶點(diǎn)專一性及其結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、研究背景:
　　海蛇中富含具有藥用價(jià)值的抗炎活性分子，其作用機(jī)理和作用靶點(diǎn)尚不明晰。青環(huán)海蛇（Hydrophis cyanocinctus）是分布于中國(guó)東南沿海的一種優(yōu)勢(shì)蛇種，自古以來(lái)就在中國(guó)被用作食材和藥材，也是被收錄入《本草綱目》的17種蛇中的其中一種，其蛇毒毒素中含有許多生物活性蛋白質(zhì)和多肽，在緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痹痛和自身免疫性炎癥疾病中有著良好的功效。由于蛇毒中抗炎活性組分的理化性質(zhì)比較接近，且有些成分豐度很低，通過(guò)傳

2、統(tǒng)的色譜技術(shù)難以分離獲得單一組分的蛇毒來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)、功能和機(jī)制方面的研究。本課題組前期利用噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)，建立了以人腫瘤壞死因子Ⅰ型受體(TNFR1)為靶點(diǎn)淘選海蛇蛇毒抗炎活性成分的方法，獲得了22氨基酸的抗炎活性肽Hydrostatin-SN1，通過(guò)同源建模、肽鏈截短并利用細(xì)胞模型及LPS誘導(dǎo)的小鼠急性休克模型篩選截短肽，得到了靶點(diǎn)特異性更強(qiáng)的十肽Hydrostatin-SN10。在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)動(dòng)物模型和炎癥性腸病(IB

3、D)動(dòng)物模型中，Hydrostatin-SN10都具有顯著的抗炎效應(yīng)，有望研發(fā)成為治療TNF-α受體(TNFRs)相關(guān)炎癥性疾病的新型靶向特異性海洋多肽類藥物。
　　TNF-α與兩型TNF受體（TNFR1和TNFR2）的相互作用及下游信號(hào)通路的異常激活是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。先導(dǎo)肽Hydrostatin-SN1與TNFR1、TNFR2均有一定的結(jié)合能力，并能拮抗TNF-α與TNFR1/TNF

4、R2的相互作用，而Hydrostatin-SN10與TNFR1的親和力更強(qiáng)，且在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中能夠在一定濃度范圍內(nèi)抑制TNFR1介導(dǎo)的下游NF-κB及MAPKs信號(hào)通路。但Hydro statin-SN10的靶點(diǎn)專一選擇性尚無(wú)明確驗(yàn)證，即是否與TNFR2結(jié)合、能否競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNF-α與TNFRs的相互作用尚沒(méi)有進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，TNFR1與Hydrostatin-SN10的結(jié)合部位、結(jié)合模式和相互作用氨基酸亦不明確。因此，驗(yàn)證Hydros

5、tatin-SN10的受體選擇性，并探究Hydrostatin-SN1/SN10同TNFR1結(jié)合的復(fù)合物構(gòu)象，將為闡明Hydrostatin-SN10特異性拮抗TNFR1發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制打下重要的基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　確證Hydrostatin-SN10對(duì)靶點(diǎn)TNFR1拮抗作用的專一性，利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法測(cè)定TNFR1-SN10復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，找到多肽與受體的結(jié)合位點(diǎn)和關(guān)鍵作用氨基酸，進(jìn)一步揭示Hydrost

6、atin-SN10選擇性拮抗TNFR1的分子機(jī)制，為多肽的結(jié)構(gòu)改造以及新型TNFR1選擇性抑制劑的研發(fā)奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、利用多種生物分子相互作用測(cè)定技術(shù)檢測(cè)Hydrostatin-SN10分別與TNFR1、TNFR2和TNF-α的相互作用，獲得親和力常數(shù)、結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)和熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)等數(shù)據(jù)，分析結(jié)合方式與性質(zhì)，并以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方法觀察Hydrostatin-SN10是否可以阻斷或抑制TNF-α與TNF

7、R1/TNFR2的相互作用。
　　2、通過(guò)不依賴連接酶的克隆(Ligation-Independent Cloning,LIC)構(gòu)建人TNFR1胞外區(qū)(sTNFR1)蛋白的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)sTNFR1，摸索合適的誘導(dǎo)表達(dá)條件;經(jīng)過(guò)親和層析、離子交換層析和分子篩層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行精細(xì)純化，獲得高純度的sTNFR1蛋白。
　　3、等溫滴定量熱法(ITC)鑒定體外表達(dá)的sTNFR1與TNF-α結(jié)合的生物學(xué)活性;微量差

8、示掃描熒光技術(shù)(nanoDSF)篩選目的蛋白穩(wěn)定性最高的緩沖液條件。
　　4、將sTNFR1與多肽Hydrostatin-SN1/SN10共孵育，采用懸滴法進(jìn)行sTNFR1-SN10復(fù)合物共結(jié)晶和sTNFR1單晶生長(zhǎng)的大規(guī)模條件初篩，對(duì)部分較好的結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)高質(zhì)量的蛋白晶體。
　　5、使用同位素標(biāo)記的氮源和碳源在M9培養(yǎng)基中表達(dá)和純化15N、13C標(biāo)記的sTNFR1蛋白;構(gòu)建麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和Hydro s

9、tatin-SN10的融合表達(dá)載體，表達(dá)純化15N、13C標(biāo)記的重組多肽Hydrostatin-SN10。
　　6、運(yùn)用核磁共振技術(shù)(NMR)分別測(cè)定15N-sTNFR1和15N-SN10的2D1H-15N HSQC波譜，然后加入相應(yīng)的未標(biāo)記配體進(jìn)行二維滴定，分析化學(xué)位移情況，驗(yàn)證sTNFR1與Hydrostatin-SN10結(jié)合的熱點(diǎn)區(qū)域(hot spots)氨基酸;將15N、13C雙標(biāo)記的蛋白和多肽孵育，收集NMR波譜數(shù)據(jù)，解

10、析復(fù)合物的溶液三維結(jié)構(gòu)。
　　研究結(jié)果:
　　1、利用表面等離子共振(SPR)、微量熱泳動(dòng)(MST)、和等溫滴定量熱法(ITC)驗(yàn)證Hydrostatin-SN10的靶點(diǎn)專一性。SPR實(shí)驗(yàn)表明，Hydrostatin-SN10能特異性結(jié)合TNFR1，而和TNFR2、TNF-α沒(méi)有特異性結(jié)合;Hydrostatin-SN10能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNF-α與TNFR1的相互作用，而對(duì)TNF-α與TNFR2的結(jié)合沒(méi)有影響。MST結(jié)果顯示

11、，Hydrostatin-SN10與TNFR1有特異性結(jié)合，親和力KD值（平衡解離常數(shù)）為2.83μM;Hydrostatin-SN10與TNFR2和TNF-α沒(méi)有相互作用。ITC結(jié)果表明，Hydrostatin-SN10與TNFR1存在相互作用，親和力約為2.29μM，與TNFR2、TNF-α沒(méi)有結(jié)合。
　　2、成功構(gòu)建人TNFR1胞外區(qū)蛋白的原核表達(dá)載體pMCSG7-sTNFR1-161、pMCSG7-sTNFR1-190、p

12、MCSG7-sumo-sTNFR1-161和pMCSG7-sumo-sTNFR1-190。使用LB培養(yǎng)基在大腸桿菌BL21中表達(dá)，優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度。確立了目的蛋白的變性、復(fù)性緩沖液體系，通過(guò)鎳柱親和層析、陽(yáng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析分離純化獲得了高純度(＞97％)的sTNFR1蛋白，其產(chǎn)量約為7.3mg每升菌液。
　　3、ITC驗(yàn)證結(jié)果表明，體外表達(dá)的重組sTNFR1-161、sTNFR1-190蛋白與TN

13、F-α有良好的結(jié)合能力，KD值分別為154.8nM和190.1nM，與文獻(xiàn)報(bào)道水平數(shù)量級(jí)一致。
　　4、nanoDSF確定了目的蛋白用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的緩沖液條件:20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，在這個(gè)溶液中sTNFR1的Tm值為77.67±0.05℃。使用96孔懸滴板進(jìn)行結(jié)晶條件初步篩選，找到了sTNFR1和TNFR1-SN10復(fù)合物的多個(gè)結(jié)晶條件，對(duì)生長(zhǎng)較好的條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了sTNFR1蛋白的高質(zhì)量

14、晶體(0.2mm×0.2mm×0.1mm)。目前TNFR1-SN10復(fù)合物的晶體正在繼續(xù)優(yōu)化中。
　　5、收集sTNFR1晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)，通過(guò)分子置換法解析數(shù)據(jù)，得到sTNFR1的高分辨率(1.69(A))三維結(jié)構(gòu)，與已報(bào)道的TNFR1胞外區(qū)晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào):1NCF)進(jìn)行疊合比對(duì)后顯示二者構(gòu)象基本一致。
　　6、使用M9培養(yǎng)基和15N-NH4Cl、13C-葡萄糖對(duì)sTNFR1進(jìn)行同位素標(biāo)記并成功表達(dá)純化出了15N

15、-13C-sTNFR1蛋白（純度＞98％）;構(gòu)建了MBP-多肽的融合表達(dá)載體pMCSG9-SN10，體外表達(dá)純化得到了15N、13C標(biāo)記的重組多肽SN10，用于NMR實(shí)驗(yàn)。
　　研究結(jié)論:
　　本研究一方面證明了青環(huán)海蛇蛇毒多肽Hydrostatin-SN10能夠?qū)Ｒ恍越Y(jié)合TNFR1，不與TNFR2或TNF-α結(jié)合，并且SN10能夠選擇性地阻礙TNF-α與TNFR1的相互作用;另一方面獲得了多肽SN10與TNFR1復(fù)合物的初