小鼠肝臟磷酸化蛋白質組學方法構建與HBx通過調控PDK1磷酸化參與HCC發(fā)生.pdf

1、磷酸化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式，調節(jié)著細胞信號轉導、細胞凋亡、肌肉收縮、新陳代謝等生物學過程，但由于蛋白質磷酸化在細胞內的低化學計量、不均一性以及實驗技術的限制，許多磷酸化現(xiàn)象還未得以發(fā)現(xiàn)。近年由于質譜技術的快速發(fā)展，結合磷酸化肽段富集技術使得對磷酸化進行大規(guī)模鑒定成為可能，結合生物信息分析，可以獲得全面的磷酸化蛋白質組的信息，為細胞基本生命活動分子機制、疾病發(fā)生機制及和藥物靶點等多方面研究提供一個有力的平臺。磷酸化蛋白質組學是一

2、種高通量蛋白分離和質譜技術結合的磷酸化蛋白鑒定的學科，通過對于磷酸化蛋白質組學數(shù)據(jù)的分析，來發(fā)現(xiàn)疾病相關的分子標志物、診斷標志物和治療靶點，蛋白質磷酸化位點、數(shù)目及其動態(tài)變化的鑒定具有十分重要的意義。
　　磷酸化修飾起到廣泛的調節(jié)作用，很多疾病的發(fā)生都是由磷酸化修飾的異常而導致的，蛋白質的磷酸化調控網(wǎng)絡是由蛋白激酶、磷酸結合蛋白、磷酸酶三個部分組成。蛋白激酶是其中重要的調節(jié)因子，很多疾病的發(fā)生與磷酸化修飾的失調和磷酸化調控網(wǎng)絡的紊

3、亂有關[2]，蛋白激酶中每一個磷酸化位點的修飾都具有重要的生物學意義，磷酸化修飾通過改變蛋白的構象改變和蛋白與蛋白之間的相互作用而起到功能調節(jié)的作用。
　　HBV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，由編碼外殼蛋白的S區(qū)、編碼核心蛋白的C區(qū)、編碼聚合酶的P區(qū)以及X區(qū)四部分組成。HBx是HBV開放閱讀塊X區(qū)編碼的的蛋白，蛋白質分子量為17kD，由154個氨基酸組成，HBx是在哺乳動物中高度保守的區(qū)域。肝細胞癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率

4、第二位，嚴重威脅著人們的健康。在我國80％肝細胞癌的發(fā)生與HBV的感染相關，HBx保守的存在于病毒DNA中，而且有一些研究認為在沒有HBV復制的情況下，HBx仍表達于肝細胞癌細胞中[3]。HBx廣泛的參與細胞的生物學過程，起到轉錄激活作用、表觀遺傳調控、細胞凋亡調節(jié)、DNA修復調節(jié)的作用，在HCC發(fā)生發(fā)展過程中，起到促進肝癌細胞增殖、轉移和侵襲的作用，因此HBx被認為是與HCC發(fā)生發(fā)展過程中的重要調節(jié)蛋白。
　　文章的第一章我們構

5、建了磷酸化蛋白質組學的方法，對正常小鼠的磷酸化蛋白質組學數(shù)據(jù)進行了收集和分析，并對該方法進行了評估。我們對小鼠肝臟進行FASP酶切，再利用TiO2對于酶切后的肽段進行富集，我們對酶切后的肽段進行分離，以提高TiO2富集磷酸化肽時的效率，最后對富集后的磷酸化肽段進行質譜分析。利用該方法，我們鑒定到了1271個磷酸化蛋白、5386磷酸化位點和4553磷酸化肽段，并對鑒定到的磷酸化修飾蛋白進行GO分析、Motif分析、激酶分類、新鑒定到的激酶

6、磷酸化位點的分析。蛋白激酶抑制劑在癌癥治療時也是主要和高效的藥物，文章中對于新的激酶位點的挖掘，可以為蛋白激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供有價值的信息，也為探討和研究磷酸化修飾蛋白在肝臟生理病理過程中發(fā)揮的重要作用奠定了堅實的基礎。
　　在文章的第二章中，我們首次對HBx轉基因肝癌小鼠肝臟和正常小鼠肝臟進行大規(guī)模高通量的差異磷酸化蛋白質組學分析，并且得到了差異的磷酸化蛋白的數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進行了進一步的挖掘和分析。在我們的研究中，利用HBx基因

7、定點插入的小鼠模型，并且生長到24個月的時候HBx基因型的小鼠形成了肝細胞癌，通過病理切片和RT-PCR的檢測，我們確認小鼠模型構建成功。利用該模型，我們對24月齡的HBx基因型小鼠和野生型小鼠進行了基于SILAC的磷酸化蛋白質組差異分析。利用HBx基因定點插入的24月齡小鼠肝癌模型和24月齡野生型小鼠模型的差異磷酸化蛋白質組的比較，我們發(fā)現(xiàn)了功能重要的PDK1和WNK1兩個激酶。在我們鑒定到數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)在HBx組PDK1和WNK1的磷酸

8、化水平發(fā)生明顯的上調，所以我們重點關注了這兩個激酶與HBx的關系，并且構建了HBx瞬時表達和穩(wěn)定表達細胞株來進一步闡述HBx對于PDK1的調控，發(fā)現(xiàn)在HBx過表達的細胞系中，p-PDK1發(fā)生明顯的上調，同時p-WNK1的磷酸化也發(fā)生明顯的上調。根據(jù)目前已有的研究，我們知道PDK1參與調控細胞增殖，當我們用PI3K和PDK1的激酶抑制劑處理細胞時，細胞增殖會被有效抑制，然而在穩(wěn)定表達HBx的細胞中，PI3K和PDK1的抑制劑的效果會減弱，

9、并且p-PDK1和p-WNK1會有劑量依賴性的下調，所以可以得出結論，HBx能夠有效抑制PI3K和PDK1抑制劑的抑制增殖的作用，并且很有可能是通過PDK1/WNK1這條通路來發(fā)揮抑制增殖作用的。在HBV相關的HCC的臨床樣本中，我們對我們的假設進行進一步的驗證，發(fā)現(xiàn)在HBV陽性的HCC中，相比于癌旁組織p-PDK1發(fā)生了顯著的上調。
　　我們利用差異磷酸化蛋白質組學的方法對肝癌小鼠和正常小鼠進行了組學分析，并對得到的差異蛋白進行