NBD多肽抑制Kupffer細(xì)胞激活改善大鼠肝移植缺血再灌注損傷的研究.pdf

1、Kupffer細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)的激活是肝移植缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)的關(guān)鍵因素之一，核因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)經(jīng)典途徑可能是KCs激活的重要信號通路。如何抑制NF-κB經(jīng)典途徑對KCs的過度激活，又不影響KCs正常功能是尚待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，NBD多肽通過干擾IKK復(fù)合物(IκB kinasecomplex)形成，能負(fù)性調(diào)

2、控NF-κB經(jīng)典途徑，但不影響其基礎(chǔ)功能。這為研究NBD多肽調(diào)控KCs活性提供了依據(jù)，其在肝移植IRI中的作用值得探索。
　　第一部分: NBD多肽抑制LPS刺激下NF-κB經(jīng)典途徑對KCs的激活
　　目的：分離培養(yǎng)Sprague Dawley(SD)大鼠肝臟KCs，觀察NBD多肽對內(nèi)毒素(Lipopolysacharide，LPS)刺激下NF-κB經(jīng)典途徑有無抑制效應(yīng)，以及對正常培養(yǎng)條件下NF-κB基礎(chǔ)活性的影響，從細(xì)胞角

3、度探討NBD多肽對NF-κB經(jīng)典途徑的作用機(jī)制。
　　方法：分離培養(yǎng)SD大鼠肝臟中KCs，在LPS刺激和正常培養(yǎng)兩種條件下，預(yù)處理不同濃度(0μg/ml，25μg/mL50μg/mL100μg/ml)的野生型NBD多肽(WT NBD)2h后，ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6水平，初步判斷NBD多肽能否抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥效應(yīng)并保護(hù)NF-κB基礎(chǔ)功能，摸索一有效的濃度；以該濃度為研究劑量，隨機(jī)分為6組：①LPS組(加入L

4、PS刺激24h)，②Mut NBD預(yù)處理組(突變型NBD多肽預(yù)處理2h后加入LPS培養(yǎng)24h)，③WT NBD預(yù)處理組(WT NBD多肽預(yù)處理2h后加入LPS培養(yǎng)24h)，④WT NBD后處理組(LPS刺激2h后加入WT NBD培養(yǎng)22h)，⑤正常培養(yǎng)組，⑥正常+WT NBD組(加入WT NBD培養(yǎng)24h)。免疫熒光檢測細(xì)胞中NF-κB/p65和IκBα表達(dá)；EMSA檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性；Western Blot檢測P-IKK-2和I

5、κBα表達(dá)；Real-time PCR檢測TNF-αmRNA含量。
　　結(jié)果：在LPS刺激下，預(yù)處理WT NBD能抑制KCs釋放TNF-α和IL-6，且抑制效應(yīng)隨濃度增加而增強(qiáng)；而在正常培養(yǎng)條件下，各濃度的WT NBD對TNF-α和IL-6的基礎(chǔ)水平無影響。以100μg/ml的濃度為研究劑量，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)：NF-κB活性、NF-κB/p65核轉(zhuǎn)錄率、P-IKK-2表達(dá)、TNF-α mRNA水平在①②③④組中較高，⑤⑥組較低。其中

6、②、④組分別與①組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，③組較①組明顯降低(P<0.05)；⑤⑥組間無明顯差別(P>0.05)。相反，IκBα的表達(dá)在①②③④組中較低，⑤⑥組較高。其中②、④組分別與①組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，③組較①組明顯增高(P<0.05)；⑤⑥組間無明顯差別(P>0.05)。
　　結(jié)論：預(yù)處理WT NBD通過降低IKK復(fù)合物磷酸化，減輕IκBα降解，能抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB經(jīng)典途徑對KCs的激活，但

7、對NF-κB的基礎(chǔ)活性具有保護(hù)作用。
　　第二部分: NBD多肽負(fù)性調(diào)控NF-κB經(jīng)典途徑改善大鼠肝移植IRI
　　目的：建立SD-SD大鼠原位肝移植模型，觀察NBD多肽預(yù)處理供肝對術(shù)后肝臟IRI有無保護(hù)作用，以及對健康大鼠NF-κB基礎(chǔ)功能的影響，探討NBD多肽改善肝移植IRI的可能機(jī)制。
　　方法：建立SD大鼠原位肝移植模型，觀察術(shù)前2h經(jīng)腹腔注射不同劑量(0mg/kg，2mg/kg，5mg/kg，8mg/kg)的

8、WT NBD預(yù)處理供體對術(shù)后3h丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotmnsferase，ALT)的影響，初步判斷預(yù)處理NBD多肽對肝移植IRI有無保護(hù)作用，并摸索一有效的劑量。以該劑量為處理因素，隨機(jī)分為4組：①NBD預(yù)處理+IRI組，②IRI組，③正常+NBD組(未行任何手術(shù)的健康大鼠經(jīng)腹腔注射WTNBD)，④正常組(健康大鼠經(jīng)腹腔注射同體積的生理鹽水作為對照)。①、②組于術(shù)后3h、6h、24h處死動物，③、④組于腹腔注射2

9、4h后收集標(biāo)本。全自動生化分析儀檢測各組中ALT水平，HE染色觀察組織病理學(xué)改變：TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；ELISA檢測血清中TNF-α含量；免疫組化檢測組織中ICAM-1、iNOS表達(dá)；EMSA檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性；Western Blot檢測P-IKK-2和IκBα表達(dá)。
　　結(jié)果：隨劑量加大，預(yù)處理NBD多肽對肝移植術(shù)后3h的ALT水平降低越明顯。以8mg/kg為研究劑量，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)：ALT水平、NF-κB活性、P-

10、IKK-2表達(dá)、TNF-α含量在①②組中增高明顯，于術(shù)后6h達(dá)峰值，但各時(shí)間點(diǎn)①組水平較②組明顯降低(P<0.05)；③④組水平較低，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。相反，IκBα的表達(dá)在①②組中降低明顯，于術(shù)后6h達(dá)最低值，但各時(shí)間點(diǎn)①組表達(dá)較②組明顯增高(P<0.05)；③④組表達(dá)較高，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后6h，①組病理損傷分級、凋亡細(xì)胞及ICAM-1、iNOS的表達(dá)明顯低于②組。
　　結(jié)論：首次證實(shí)以

11、WT NBD預(yù)處理供體，通過負(fù)性調(diào)控肝臟中NF-κB經(jīng)典途徑，能有效改善移植術(shù)后IRI，但不影響體內(nèi)NF-κB的基礎(chǔ)活性。
　　第三部分: NBD多肽抑制移植肝臟中NF-κB經(jīng)典途徑對KCs的激活
　　目的：分離術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)移植肝臟中的KCs，觀察其IKK復(fù)合物-NF-κB信號通路的變化，證實(shí)預(yù)處理NBD多肽抑制了NF-κB經(jīng)典途徑對KCs的激活。方法：于肝移植術(shù)后3h、6h、24h，分離第二部分①、②兩組供肝中的KCs。

12、EMSA檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，Western Blot檢測P-IKK-2和IκBα，表達(dá)，Real-time PCR檢測TNF-α mRNA水平。
　　結(jié)果：在各時(shí)間點(diǎn)，①組中NF-αB活性、P-IKK-2的表達(dá)、TNF-αmRNA水平較②組明顯降低(P<0.05)，而IκBα，的表達(dá)較②組明顯增高(P<0.05)。
　　結(jié)論：預(yù)處理NBD多肽抑制了缺血再灌注過程中NF-κB經(jīng)典途徑對KCs的激活，對KCs活性的調(diào)控是NB