轉(zhuǎn)基因金龜子綠僵菌獲得的口服毒力評(píng)價(jià)與自噬基因ATG5對(duì)球孢白僵菌生防潛能的貢獻(xiàn).pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)等昆蟲病原真菌被廣泛用于農(nóng)林害蟲防治，因而稱為害蟲蟲生真菌。它們的殺蟲機(jī)理無一例外地都是通過昆蟲體壁侵入血腔而誘發(fā)昆蟲病害和死亡，而不能通過口器攝入孢子的途徑從消化道侵入寄主。蟲生真菌的生防潛能既取決于侵染體對(duì)靶標(biāo)害蟲的侵染力或毒力，也取決于侵染體對(duì)夏季高溫、陽光紫外輻射等脅迫因素的耐受力。本研究的目標(biāo)，一是解決表達(dá)異源昆蟲腸

2、毒蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌的絕對(duì)口服毒力評(píng)價(jià)的技術(shù)難題，在本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)之上進(jìn)一步夯實(shí)蟲生真菌通過遺傳改良獲得胃毒殺蟲活性而研制新一代雙途徑侵染的安全高效廣譜真菌殺蟲劑的科學(xué)基礎(chǔ);二是解析球孢白僵菌自噬相關(guān)基因ATG5(BbATG5)的功能，首次探索細(xì)胞自噬可能對(duì)蟲生真菌生長發(fā)育及生防潛能的影響，為蟲生真菌細(xì)胞自噬的深入研究積累經(jīng)驗(yàn)。主要結(jié)果總結(jié)如下。
　　 表達(dá)昆蟲腸毒蛋白的金龜子綠僵菌工程菌構(gòu)建及其口服毒力測定以高效侵染蚜蟲、

3、飛虱、葉螨等刺吸式口器害蟲但不能經(jīng)體壁有效侵染斜紋夜蛾(Spodopteralitura)低齡幼蟲的金龜子綠僵菌野生菌株Ma456為受體菌，運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)營養(yǎng)生長期微量分泌的非晶體昆蟲腸毒蛋白Vip3Aa1基因?qū)胧荏w菌株中組成性表達(dá)，篩選獲得一株生長產(chǎn)孢性狀良好且穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)基因的工程菌株MaVipB

4、01。將野生菌株與工程菌株的分生孢子配制成1×106、1×107和1×108個(gè)孢子/mL的懸液，在自動(dòng)噴塔中將各菌株低、中、高濃度的孢子懸液依次等量(1 mL)噴霧到直徑約為13cm的甘藍(lán)葉圓片上，空氣干燥數(shù)分鐘后供斜紋夜蛾一至四齡幼蟲取食，每天按需更換相同噴菌處理的新鮮葉片。如此供食8天，每天觀察記錄試蟲死亡率、存活幼蟲的平均葉片取食量（cm2/頭）及體重(mg/頭)，并根據(jù)不同噴菌處理葉片上的孢子沉降量(孢子數(shù)/mm2)估計(jì)各處理存

5、活幼蟲的孢子累計(jì)攝入量（孢子數(shù)/頭），每濃度處理重復(fù)三次，每重復(fù)試蟲28～40頭，以綜合評(píng)價(jià)表達(dá)Vip3Aa1毒蛋白的工程菌株對(duì)試蟲的胃毒殺蟲活性和口服毒力。
　　 結(jié)果顯示，一至四齡幼蟲通過取食野生株高濃度噴菌葉片的攝入量分別達(dá)到2.28×105、1.88×106、5.22×106和8.11×106個(gè)孢子/頭，而無論蟲齡高低其死亡率始終與對(duì)照無異（5％左右）。所獲少量蟲尸經(jīng)保溫培養(yǎng)，也未見真菌病害致死的典型癥狀，而且同一蟲齡的

6、各處理間在幼蟲的葉片取食量和體重方面均無顯著差異。顯然，野生株無法通過大量攝入孢子誘發(fā)試蟲的實(shí)質(zhì)性感染，與噴菌葉片接觸也未能誘發(fā)孢子經(jīng)體壁附著的實(shí)質(zhì)性感染。與此形成鮮明對(duì)比的是，取食工程菌株噴菌葉片的各齡幼蟲，其累計(jì)死亡率、葉片攝入量、體重及攝孢子入量，均隨供食葉片的噴菌濃度而變化。其中，一齡幼蟲取食高濃度噴菌葉片第2～4天的死亡率分別為44％、87％和97％，葉片取食量分別比對(duì)照降低69％、76％和83％，期間存活幼蟲體重分別下降47

7、％、57％和80％，相對(duì)應(yīng)的孢子攝入量僅為2.8、4.2和5.2×103個(gè)/頭。隨著個(gè)體和蟲齡的增大，帶菌葉片取食量或孢子攝入量更大才能誘發(fā)與較小個(gè)體或較低蟲齡相同的死亡率。取食高濃度噴菌葉片的四齡幼蟲第6～8天攝入7.9、9.9和12.1×105個(gè)孢子后才分別死亡45％、62％和69％，期間存活幼蟲的葉片取食量和體重分別下降～85％和84～91％。取食工程菌分生孢子而死亡的幼蟲，無論蟲齡高低，均表現(xiàn)典型的中毒癥狀，如個(gè)體顯著變小、食量

8、減少及行動(dòng)遲緩。
　　 工程菌株對(duì)各齡幼蟲的生測數(shù)據(jù)經(jīng)時(shí)間—?jiǎng)┝俊劳雎誓Ｐ偷臄M合分析，獲得隨取食帶菌葉片時(shí)間而變化的半致死濃度LC50和隨供食葉片噴菌濃度而變化的半致死時(shí)間LT50，即為口服毒力的定量指標(biāo)。據(jù)此，葉片上工程菌孢子達(dá)到1293個(gè)/mm2，初孵一齡幼蟲取食第2天即可死亡50％，取食第3～5天死亡一半所需的理論噴菌濃度分別降為103、28和8個(gè)孢子/mm2，事實(shí)上該齡幼蟲取食高濃度處理葉片的第5天即全部死亡。二齡幼蟲

9、需要取食1500個(gè)/mm2的帶菌葉片4天才死亡一半，第5～8天死亡一半的葉片帶菌量分別降為537、152、83和45個(gè)孢子/mm2。殺三齡幼蟲50％所需的噴菌濃度與二齡幼蟲的接近，或許因?yàn)槠湓黾拥捏w重剛好抵銷攝食量提高的影響。進(jìn)入暴食期的四齡幼蟲個(gè)體更大，取食帶菌葉片第6～8天死亡一半所需的噴菌濃度分別為1760、730和410個(gè)孢子/cm2。
　　 自噬因子BbATG5對(duì)球孢白僵菌生長發(fā)育及毒力的影響從球孢白僵菌野生株Bb28

10、60中克隆獲得自噬相關(guān)基因BbATG5的金長ORF(905bp)及其2382、1129bp的上下游側(cè)翼序列。其ORF帶一個(gè)95bp的內(nèi)含子，編碼由269個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，以單拷貝的形式存在于基因組中。將BbATG5的部分片段(49bp)用帶bar標(biāo)記基因的表達(dá)盒(942bp)進(jìn)行替代而同源重組，構(gòu)建靶基因敲除突變株△BbATG5。隨后在敲除株中轉(zhuǎn)入由BbATG5全長編碼序列及其啟動(dòng)子(上游2.6kb)和磺酰脲抗性基因sur組成的表達(dá)

11、盒進(jìn)行靶標(biāo)基因的拯救而構(gòu)建回補(bǔ)株△BbATG5::BbATG5。
　　 將野生株、敲除株和回補(bǔ)株的液培菌絲在含50mM LiCl的除氮察氏培養(yǎng)液Cz-N（氮饑餓脅迫）中誘導(dǎo)培養(yǎng)3h后，收集菌絲并用單丹磺酰戊二胺MDC染色。熒光顯微鏡觀察顯示，野生株和回補(bǔ)株的菌絲細(xì)胞中均有大量自噬體和溶酶體出現(xiàn)，而敲除株細(xì)胞中雖可見較明顯的溶酶體，但自噬體稀有。透射電鏡觀察進(jìn)一步證實(shí)誘導(dǎo)后的野生株和回補(bǔ)株菌絲細(xì)胞的液泡中存在大量自噬體，而同樣誘導(dǎo)

12、的敲除株細(xì)胞中少有自噬體。這些結(jié)果證實(shí)球孢白僵菌在氮饑餓條件下會(huì)發(fā)生細(xì)胞自噬現(xiàn)象，而BbATG5的缺失可阻礙自噬發(fā)生。
　　 用流式細(xì)胞儀進(jìn)行各菌株分生孢子的前向散射(FSc)和側(cè)向散射(SSc)檢測，發(fā)現(xiàn)敲除株分生孢子增大約20％，且伴隨明顯的形態(tài)畸變。在察氏培養(yǎng)基(CzA)上，野生株和回補(bǔ)株的孢子萌發(fā)率基本保持100％，而敲除株的卻降低～20％。在無氮源的CzA-N平板和無營養(yǎng)的吐溫-80水瓊脂平板上，野生株和回補(bǔ)株的孢子萌

13、發(fā)率分別降低60％和43％左右，而敲除株的分別僅有～20％和不足5％。將各菌株在薩氏培養(yǎng)基SDA、燕麥培養(yǎng)基OMA、CzA和CzA-N等不同營養(yǎng)的平板上培養(yǎng)7天，發(fā)現(xiàn)敲除株在CzA上的營養(yǎng)生長顯著慢于野生株和回補(bǔ)株。而其在CzA-N上的營養(yǎng)生長則減慢50％左右，且敲除株菌落中的菌絲變得稀疏。在富營養(yǎng)的SDA和OMA上，敲除株的營養(yǎng)生長雖與野生株和回補(bǔ)株無明顯差異，但其產(chǎn)孢量卻大幅度下降80％左右。在富營養(yǎng)的培養(yǎng)液SDB中接種106個(gè)分生

14、孢子/mL進(jìn)行36h搖床培養(yǎng)，敲除株僅產(chǎn)0.52×107個(gè)芽生孢子/mL，比野生株和回補(bǔ)株少產(chǎn)芽生孢子94～97％。用斜紋夜蛾二齡幼蟲對(duì)各菌株進(jìn)行同一濃度(107個(gè)孢子/mL)等量孢子懸液的標(biāo)準(zhǔn)化噴菌生物測定，野生株、敲除株和回補(bǔ)株對(duì)試蟲的LT50分別為5天、7天和5天，即敲除株的毒力降低40％。
　　 結(jié)語以上結(jié)果表明，組成性表達(dá)異源腸毒蛋白的金龜子綠僵菌工程菌株，通過獲得胃毒殺蟲活性，不僅拓寬了真菌的寄主范圍，而且使原本對(duì)斜