亞洲帶絳蟲實驗感染乳豬肝細胞MAPK信號通路的研究.pdf

1、目的：
　　1.探索亞洲帶絳蟲實驗感染乳豬后不同時間囊尾蚴寄生處肝細胞MAPK信號通路相關基因表達的變化，以及亞洲帶絳蟲感染乳豬所致肝細胞活力的變化，為闡明亞洲帶絳蟲感染所致中間宿主肝損傷的分子機理提供基礎資料。
　　2.了解MAPK特異性抑制劑干預后亞洲帶絳蟲感染早期乳豬肝細胞MAPK信號通路相關基因表達、細胞活力和細胞凋亡的變化，探究MAPK特異性抑制劑是否能夠減輕亞洲帶絳蟲所致肝組織損傷，進一步為抗囊尾蚴病的藥物研發(fā)及

2、囊尾蚴病的治療提供新的、有價值的基礎資料。
　　方法：
　　1.從貴州省都勻市墨沖鎮(zhèn)采用檳榔-南瓜子法對患者進行驅(qū)蟲治療，收集帶絳蟲成蟲標本。觀察蟲體一般形態(tài)學特征，并提取孕節(jié)DNA進行分子生物學鑒定，以確定采集的蟲體為亞洲帶絳蟲。
　　2.從亞洲帶絳蟲成蟲孕節(jié)分離蟲卵，離心沉淀收集蟲卵懸液。20日齡約克二元施格雜交乳豬50頭，隨機分為實驗組36頭（感染組15頭和抑制劑干預組21頭）和正常對照組14頭，兩實驗組均以定量

3、蟲卵15萬個/頭灌胃感染，抑制劑干預組自灌胃之日起每頭乳豬分別腹腔注射抑制劑U0126、SB203580和SP6001251mg/kg，隔天一次，連續(xù)注射7次。于感染后第15、45和75天麻醉處死各組乳豬4～7頭，以獲得各組乳豬肝臟。
　　3.用cck-8法檢測各組肝細胞生長抑制率；用熒光定量PCR技術檢測各組乳豬肝細胞的ERK1、p38和JNK1基因mRNA的相對表達量；并用流式細胞術檢測各組乳豬肝細胞的凋亡率。采用方差分析對數(shù)

4、據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　　1.采集的4條帶絳蟲呈乳白色，長1.55～3.65m，節(jié)片數(shù)為562～877節(jié)，節(jié)片較薄。經(jīng)醋酸明礬卡紅染色見蟲體頭節(jié)近方形，有4個吸盤，無頂突和小鉤，成節(jié)卵巢為2葉，孕節(jié)子宮每側分支數(shù)為16～25支。帶絳蟲提取的DNA經(jīng)亞洲帶絳蟲cox1基因片段的特異性引物PCR，均擴增出260bp的產(chǎn)物。根據(jù)一般形態(tài)學特征和分子生物學鑒定結果，證實4條墨沖鎮(zhèn)采集的帶絳蟲為亞洲帶絳蟲。
　　2.實

5、驗組36頭乳豬均感染上亞洲帶絳蟲囊尾蚴，感染率為100％。囊尾蚴只存在于乳豬肝臟，其它組織未檢獲。
　　3.
　?。?)cck-8法檢測各組肝細胞的生長抑制率：感染后第15、45和75天，感染組肝細胞的生長抑制率分別為（23.11±1.26）%、（25.15±1.26）%和（20.72±1.3）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。感染后第15天，U0126干預組、SB203580干預組和 SP600125干預組的肝細胞生長

6、抑制率分別是（12.59±1.2）%、（16.48±0.7）%、（18.3±0.75）%，均較感染組明顯下降（P<0.05）。
　?。?）流式細胞儀檢測各組肝細胞凋亡率：感染后第15天，感染組和抑制劑干預組的肝細胞凋亡率均較正常對照組明顯增高（P<0.05），U0126干預組肝細胞凋亡率較感染組明顯增高（P<0.05），SB203580和SP600125干預組肝細胞凋亡率均較感染組降低（P<0.05）。感染后第75和45天感染組的

7、肝細胞凋亡率均較感染后第15天明顯增高（P<0.05），且感染后第75天感染組的肝細胞凋亡率明顯高于感染后45天（P<0.05）。
　?。?）熒光定量PCR檢測各組肝細胞MAPK信號通路相關基因mRNA的相對表達量：感染后第15、45和75天，感染組的ERK1和p38 mRNA表達水平均較對照組上調(diào)，而JNK1 mRNA表達水平均較對照組下調(diào)，隨感染時間延長ERK1和p38 mRNA表達水平均明顯下調(diào)（P<0.05）。感染后第15

8、天，U0126干預組的ERK1 mRNA表達水平較對照組明顯上調(diào)（P<0.05）；SB203580干預組的p38 mRNA表達水平較對照組明顯上調(diào)（P<0.05），但SB203580干預組較感染組明顯下調(diào)（P<0.05）；SP600125干預組的JNK1 mRNA表達水平較對照組明顯下調(diào)（P<0.05），且SP600125干預組較感染組明顯下調(diào)（P<0.05）。
　　結論：
　　1.成功建立了亞洲帶絳蟲感染和 MAPK特異性