結核分枝桿菌脂肪酸代謝途徑中相關酶和蛋白的分子生物學及三維結構的研究.pdf

1、結核病作為全球性的健康問題，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升態(tài)勢。分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是已經發(fā)現(xiàn)的最為重要的傳染性病原體之一，它能夠在宿主巨噬細胞中持續(xù)存活，每年引起八百萬人感染，其中有三百萬病人由于得不到合理的治療而死亡。此外，在過去40年以來，一直沒有開發(fā)出治療效果比異煙肼更優(yōu)的藥物。而多耐藥菌株(Muti-drugresistant，MDR)的出現(xiàn)和廣泛傳播，以及與艾滋病的共同作用，使得結核病的

2、疫情進一步惡化。開發(fā)更有效、更快速的抗結核新藥，徹底攻克結核病已勢在必行。 結核桿菌的基因組含4000多個基因，其中有250個基因編碼脂肪酸代謝相關的酶，和大腸桿菌相比多了4倍有余。結核桿菌的細胞壁以肽聚糖為基本架構，共價結合阿拉伯半乳糖及分支菌酸。分支菌酸是自然界中最大的脂肪酸，它和結核桿菌的毒力、結核桿菌逃逸免疫系統(tǒng)攻擊的能力息息相關。另外，細胞壁所含的脂類約占細胞壁干重的60％等等，這些事實均說明了脂肪酸代謝對結核桿菌的重

3、要性。丙二酰CoA：ACP轉化酶(Malony-CoA：ACPtransacylase，MCAT)是脂肪酸代謝中的一個關鍵酶，催化Malonyl-CoA形成Malonyl-ACP，后者進入脂肪酸碳鏈延長循環(huán)，每次增加2個碳原子。ACP(Acylcarrierprotein)是FASII系統(tǒng)中的小且酸性的蛋白，它在脂肪酸代謝中起著重要作用，與大分子脂肪酸的合成及結核細胞壁的裝配緊密相關。ACP與MCAT都是很好的抗結核藥物靶位的候選對象。

4、 本論文共克隆、表達、純化了結核桿菌的兩個MCAT和三個可能的ACP蛋白，并檢測了這些蛋白的一些生理生化功能及特性。在酶活測定中，我們了解到FabD和FabD2的性能相近，幾種二價陽離子對酶活的影響不大；Rvl344轉錄的蛋白確實具有載酰功能，而Rv0033可能在別的通路中發(fā)揮作用。RT-PCR試驗闡明了兩個MCAT蛋白在結核桿菌侵入巨噬細胞后的轉錄情況，其中FabD的表達上調，而FabD2表達量減少，證實了結核桿菌兩個MCAT

5、蛋白在結核病急性及持續(xù)感染中的重要性。通過Western檢測，耐藥菌株感染的病人血清和敏感株病人血清中都具有Acpl344的抗原，說明了Acpl344的重要性及它作為結核診斷的輔助指標的可能。此外，我們還通過Rvl344基因的定點突變試驗，驗證了Acpl344蛋白中一些序列的重要性與保守性。 圓二色譜的測定，使我們得到了幾種蛋白的二級結構。為了獲得這些蛋白的三維結構，設計出活性小分子化合物，我們還與清華大學結構生物學實驗室合作，