結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Rv0315三維結(jié)構(gòu)的解析及生物學功能的研究.pdf

1、結(jié)核病是一種古老的細菌性疫病，是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染或者長期潛伏引起的嚴重危害人類和動物健康的傳染病。在世界范圍內(nèi)，大約有二十億人潛伏感染了結(jié)核分枝桿菌，造成了每年約兩百萬人的死亡，它仍然是引起發(fā)病率和死亡率的主要病原。
　　2012年Eui-H ong Byun等人將結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白通過液相色譜法分離并收集，并用不同管數(shù)的蛋白處理DC細胞，發(fā)現(xiàn)Rv0315蛋白可以通過激活

2、NF-κB信號通路以及MAPK信號通路顯著性的誘導DC細胞的成熟，是一個新發(fā)現(xiàn)的潛在的免疫性抗原。
　　為了解決結(jié)核分枝桿菌的耐藥性以及市場上現(xiàn)有疫苗效果的局限性這一現(xiàn)狀，我們需要探究新的結(jié)核疫苗候選分子的一些特性，因此開展了關(guān)于Rv0315的結(jié)構(gòu)和功能的研究。利用結(jié)構(gòu)生物學平臺我們首次解析了Rv0315的三維結(jié)構(gòu)，并對它的功能以及發(fā)揮功能的機制進行了研究和探討。具體研究內(nèi)容如下:
　　Rv0315屬于β-1,3葡聚糖酶家族

3、。β-1，3葡聚糖酶屬于糖苷水解酶16家族，他們具有序列和結(jié)構(gòu)的同源性?；谶@個共性，我們首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中將目前已知結(jié)構(gòu)和功能的所有β-1，3葡聚糖酶的氨基酸序列導出，并將它們與Rv0315一起做了氨基酸的多序列比對，Rv0315在序列上展示出與β-1，3葡聚糖酶較高的序列同源性，保守的兩個谷氨酸催化位點以及鈣離子結(jié)合位點都是存在的。通過序列比對我們發(fā)現(xiàn)Rv0315屬于β-1，3葡聚糖酶家族。
　　GH16家族的β-1，3葡

4、聚糖酶還有一個特點就是結(jié)構(gòu)的同源性也很高，基于β-1，3葡聚糖酶家族的這個共性，我們首先構(gòu)建了H37Rv株Rv0315全長的表達質(zhì)粒pET42b-Rv0315，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得了可溶性表達的蛋白。通過實驗室已有的晶體篩選試劑盒篩選和優(yōu)化得到一個分辨率達1.7(A)的晶體，收集數(shù)據(jù)并通過分子置換的方法解析了Rv0315的結(jié)構(gòu)。由Rv0315的結(jié)構(gòu)可以看出它符合β-1，3葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)特征，包括16個β折疊形成的兩個β片層，β片層彎

5、曲形成一個凹面，是一個催化活性中心;兩個較短的α螺旋和一個鈣離子。通過以上從序列和結(jié)構(gòu)上分析，我們發(fā)現(xiàn)Rv0315是一個β-1，3葡聚糖酶。
　　Rv0315是一個沒有活性的β-1，3葡聚糖酶。細菌產(chǎn)生的β-1，3葡聚糖酶都屬于糖苷水解酶16家族，所有的β-1，3葡聚糖酶都可以水解β-1，3糖苷鍵的糖，例如昆布多糖，少部分也可以水解β-1，3-1，4糖苷鍵的糖，例如大麥來源的β葡聚糖。Rv0315是一個β-1，3葡聚糖酶，所以我們

6、通過DNS實驗測定了其對昆布多糖以及大麥來源的β葡聚糖的水解活性。奇怪的是，Rv0315既不能降解昆布多糖，同時對大麥來源的β葡聚糖也沒有可檢測到的水解活性。從以上結(jié)果可知，Rv0315是一個沒有活性的β-1，3葡聚糖酶。我們將目前已知結(jié)構(gòu)和功能的GH16家族的β-1，3葡聚糖酶做了進化樹分析，結(jié)果顯示Rv0315與海魚分枝桿菌的β-1，3葡聚糖酶（PDB號4PQ9）形成了一個獨立的進化分支。4PQ9的結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，功能沒有相關(guān)的報道，

7、相關(guān)文章對該基因的標注是β-1，3葡聚糖酶。我們合成了4PQ9基因并成功獲得了可溶性的蛋白，我們利用同樣的方法檢測了4PQ9的水解活性，結(jié)果表明4PQ9也是一個沒有活性的β-1，3葡聚糖酶。我們發(fā)現(xiàn)了GH16家族β-1，3葡聚糖酶中一個獨立的進化分支，這個分支是由兩個沒有活性的β-1，3葡聚糖酶組成。
　　Rv0315沒有多糖水解活性的分子機制。我們通過比對Rv0315與海洋細菌的β-1，3葡聚糖酶(PDB號4BOW)的結(jié)構(gòu)來解釋

8、Rv0315沒有水解活性的機制。4BOW對昆布多糖有很高的催化活性，同時也可以水解MLG。MLG是一種β-1，3-1，4葡聚糖，跟大麥來源的β葡聚糖相似。通過結(jié)構(gòu)比較我們發(fā)現(xiàn)，4BOW中-2位以及-3位跟多糖結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基在GH16家族β-1，3葡聚糖酶中都是保守的，但Rv0315中都是缺失或者突變的，而-1位的跟葡萄糖單位結(jié)合的氨基酸在Rv0315中也是保守的。所以，目前所知道的Rv0315唯一可以結(jié)合的分子就是乙二醇。乙二醇分

9、子是在Rv0315結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的，結(jié)合的位置跟-1位的葡萄糖單位所在的位置類似。從整體結(jié)構(gòu)比較可以看出，Rv0315的催化裂開口很大。由結(jié)構(gòu)比較的結(jié)果可以看出Rv0315由于結(jié)合底物相關(guān)的氨基酸的缺失或者突變使其催化裂的開口較大，導致Rv0315不能結(jié)合多糖進而不能水解多糖。我們通過ITC實驗驗證了Rv0315確實不能結(jié)合昆布多糖，而4BOW-E269S可以結(jié)合多糖并呈現(xiàn)很好的擬合曲線。一個昆布多糖分子可以結(jié)合兩個4BOW-E269S分子

10、。
　　Rv0315的結(jié)構(gòu)與其發(fā)揮免疫學功能的關(guān)系。Rv0315雖然是一個沒有活性的β-1，3葡聚糖酶，但其兩個擔當催化作用的谷氨酸位點還是存在的。Rv0315可能在長期進化過程中失去水解多糖的功能進而參與發(fā)揮免疫學功能。因為Rv0315開口比較大，當結(jié)核分枝桿菌入侵機體時可能更容易暴露而受到免疫相關(guān)分子的攻擊，因此參與適應性免疫應答。為了驗證我們的推測，我們通過熒光素酶報告實驗來檢測Rv0315以及突變體Rv0315E176S、

11、Rv0315D289A對NF-κB信號通路的激活情況，Rv0315以及Rv0315D289A可以激活NF-κB信號通路并且呈劑量依賴性。而催化活性位點176位的突變體則不能激活NF-κB信號通路。此外，我們還用不同濃度的Rv0315以及突變體蛋白處理DC細胞，檢測它們誘導DC細胞成熟的能力，結(jié)果跟熒光素酶報告實驗的結(jié)果相同，Rv0315和Rv0315D289A可以誘導DC細胞成熟，而Rv0315E176S則不能誘導DC細胞的成熟。