結(jié)核分枝桿菌脂肪酸代謝途徑中相關(guān)酶和蛋白的分子生物學(xué)及三維結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、結(jié)核病作為全球性的健康問(wèn)題，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升態(tài)勢(shì)。分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最為重要的傳染性病原體之一，它能夠在宿主巨噬細(xì)胞中持續(xù)存活，每年引起八百萬(wàn)人感染，其中有三百萬(wàn)病人由于得不到合理的治療而死亡。此外，在過(guò)去40年以來(lái)，一直沒(méi)有開(kāi)發(fā)出治療效果比異煙肼更優(yōu)的藥物。而多耐藥菌株(Muti-drugresistant，MDR)的出現(xiàn)和廣泛傳播，以及與艾滋病的共同作用，使得結(jié)核病的

2、疫情進(jìn)一步惡化。開(kāi)發(fā)更有效、更快速的抗結(jié)核新藥，徹底攻克結(jié)核病已勢(shì)在必行。 結(jié)核桿菌的基因組含4000多個(gè)基因，其中有250個(gè)基因編碼脂肪酸代謝相關(guān)的酶，和大腸桿菌相比多了4倍有余。結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁以肽聚糖為基本架構(gòu)，共價(jià)結(jié)合阿拉伯半乳糖及分支菌酸。分支菌酸是自然界中最大的脂肪酸，它和結(jié)核桿菌的毒力、結(jié)核桿菌逃逸免疫系統(tǒng)攻擊的能力息息相關(guān)。另外，細(xì)胞壁所含的脂類(lèi)約占細(xì)胞壁干重的60％等等，這些事實(shí)均說(shuō)明了脂肪酸代謝對(duì)結(jié)核桿菌的重

3、要性。丙二酰CoA：ACP轉(zhuǎn)化酶(Malony-CoA：ACPtransacylase，MCAT)是脂肪酸代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化Malonyl-CoA形成Malonyl-ACP，后者進(jìn)入脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)循環(huán)，每次增加2個(gè)碳原子。ACP(Acylcarrierprotein)是FASII系統(tǒng)中的小且酸性的蛋白，它在脂肪酸代謝中起著重要作用，與大分子脂肪酸的合成及結(jié)核細(xì)胞壁的裝配緊密相關(guān)。ACP與MCAT都是很好的抗結(jié)核藥物靶位的候選對(duì)象。

4、 本論文共克隆、表達(dá)、純化了結(jié)核桿菌的兩個(gè)MCAT和三個(gè)可能的ACP蛋白，并檢測(cè)了這些蛋白的一些生理生化功能及特性。在酶活測(cè)定中，我們了解到FabD和FabD2的性能相近，幾種二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)酶活的影響不大；Rvl344轉(zhuǎn)錄的蛋白確實(shí)具有載酰功能，而Rv0033可能在別的通路中發(fā)揮作用。RT-PCR試驗(yàn)闡明了兩個(gè)MCAT蛋白在結(jié)核桿菌侵入巨噬細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄情況，其中FabD的表達(dá)上調(diào)，而FabD2表達(dá)量減少，證實(shí)了結(jié)核桿菌兩個(gè)MCAT

5、蛋白在結(jié)核病急性及持續(xù)感染中的重要性。通過(guò)Western檢測(cè)，耐藥菌株感染的病人血清和敏感株病人血清中都具有Acpl344的抗原，說(shuō)明了Acpl344的重要性及它作為結(jié)核診斷的輔助指標(biāo)的可能。此外，我們還通過(guò)Rvl344基因的定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)，驗(yàn)證了Acpl344蛋白中一些序列的重要性與保守性。 圓二色譜的測(cè)定，使我們得到了幾種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。為了獲得這些蛋白的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出活性小分子化合物，我們還與清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室合作，