梅毒螺旋體核酸檢測及基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的梅毒螺旋體核酸絕對定量方法學研究.pdf

1、第一部分：各期梅毒外周血中梅毒螺旋體核酸檢出率的研究
　　目的：利用巢式PCR技術(shù)探究各期梅毒患者外周血中梅毒螺旋體DNA的檢出率。
　　方法：臨床收集192例梅毒患者外周血樣本，其中包括37例一期梅毒，92例二期梅毒，63例潛伏梅毒，利用TP0105和TP0574基因片段特異的內(nèi)外引物，行巢式PCR技術(shù)對樣本進行檢測。
　　結(jié)果：一期梅毒患者外周血中梅毒螺旋體的檢出率為45.9%（TP0105）和40.5%（TP05

2、74），兩基因的總檢出率為48.6%；二期梅毒患者外周血中梅毒螺旋體的檢出率為52.2%（TP0105）和52.2%（TP0574），兩基因的總檢出率為62.0%；潛伏梅毒患者外周血中梅毒螺旋體的檢出率為6.3%（TP0105）和4.8%（TP0574），兩基因的總檢出率為7.9%。兩基因的檢出率在統(tǒng)計學上沒有差異（P<0.05），Kappa值為0.714。
　　結(jié)論：梅毒螺旋體基因可以在螺旋體感染的各個階段的梅毒患者外周血中檢測

3、到，其中在一期梅毒和二期梅毒中的檢出率最高。巢式PCR技術(shù)在早期梅毒的診斷中起到了重要的作用，可以在臨床上用于暗視野鏡檢和血清學檢測的補充診斷標準。
　　第二部分：基于微滴式數(shù)字 PCR技術(shù)的梅毒螺旋體核酸絕對定量方法的建立及應(yīng)用
　　微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一項基于單分子PCR方法來進行計數(shù)的核酸分子絕對定量技術(shù)，目前基于該技術(shù)的梅毒螺旋體絕對定量方法還未有文獻報道。本研究建立了微滴式數(shù)字PCR梅毒螺旋體

4、核酸絕對定量檢測平臺，從特異性、靈敏度、可信度、重復性幾個方面對平臺進行評估，又將建立好的ddPCR檢測平臺應(yīng)用于TP感染兔模型外周血的核酸檢測，確定該技術(shù)的可行性。
　　本研究設(shè)計了針對基因分別為TP0105和TP0574的特異性探針，利用ddPCR技術(shù)檢測了健康人、非梅毒病人、正常兔、鼠血漿中的目的基因片段，確定了該技術(shù)的空白下限值（LOB）為3.2copies（TP0105）和1.4copies（TP0574），為后續(xù)對于臨

5、床樣本的檢測確定了cut-off值。用ddPCR技術(shù)對各稀釋梯度的質(zhì)粒進行核酸定量檢測，確定該檢測技術(shù)的高靈敏度，最低檢測下限（LOD）為單拷貝。將每個梯度質(zhì)粒經(jīng)ddPCR檢測出的實際拷貝數(shù)與計算出的理論拷貝數(shù)進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)二者呈高度相關(guān)性，說明 ddPCR技術(shù)的檢測結(jié)果是可信的。為了評估ddPCR的重復性，我們對各稀釋梯度兔睪丸懸液的檢測均進行了三次重復，對三次拷貝數(shù)結(jié)果進行分析研究發(fā)現(xiàn)每個稀釋梯度的RSD值均在可接受的范圍內(nèi)，表

6、明 ddPCR具有很好的可重復性。在ddPCR與qPCR的對比研究中我們發(fā)現(xiàn)ddPCR具有比qPCR更低的檢測下限，靈敏度更高，且ddPCR具有比qPCR更好的重復性，特別是在目的基因處于低拷貝的情況下。
　　本研究利用ddPCR技術(shù)動態(tài)監(jiān)測了兔模型對TP的感染情況，發(fā)現(xiàn)感染兔外周血中核酸水平的出現(xiàn)早于血清學水平，證實了ddPCR技術(shù)的可行性，為后續(xù)對于臨床樣本的核酸絕對定量研究奠定了基礎(chǔ)，對指導用于極早期梅毒、胎傳梅毒、神經(jīng)梅毒