硒蛋白S基因敲低改善非酒精性脂肪肝和胰島素抵抗的作用及其機(jī)制.pdf

1、硒蛋白S（SelS）是一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留硒蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)禁食后的2型糖尿病（T2D）、肥胖或胰島素抵抗（IR）模型大鼠肝組織SelS基因表達(dá)量升高；也有研究發(fā)現(xiàn)在H4IIE肝細(xì)胞中過表達(dá)SelS會(huì)損害胰島素敏感性而影響糖代謝；我們實(shí)驗(yàn)室前期工作中也發(fā)現(xiàn)SelS基因敲低會(huì)改善軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的IR狀態(tài)，且其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MP激活的蛋白激酶（AMPK），抑制JNK有關(guān)。綜合以上的研究發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為確定SelS與T2D等代謝疾病的

2、關(guān)系仍缺少切實(shí)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。因此，在體內(nèi)外模型中繼續(xù)探討SelS與T2D的作用關(guān)系，對(duì)于揭示硒和SelS在代謝性疾病中扮演的角色以及發(fā)現(xiàn)治療的新靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　本文首先對(duì)于T2D、IR和非酒精性脂肪肝（NAFLD）的關(guān)系、肝組織脂類代謝、AMPK的基本情況和SelS與糖脂代謝的關(guān)系等進(jìn)行了綜述。在此基礎(chǔ)上，以db/db小鼠和高脂飼料誘導(dǎo)肥胖（DIO）小鼠作為體內(nèi)研究對(duì)象，以游離脂肪酸（FFA）造模

3、的HepG2細(xì)胞作為體外研究對(duì)象，針對(duì)SelS與糖脂代謝的作用關(guān)系問題開展研究，主要結(jié)果如下：
　　（1）應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)、qRT-PCR法、蛋白質(zhì)印跡、GC-MS和HPLC等方法研究SelS基因敲低對(duì)于db/db小鼠糖脂代謝的影響。結(jié)果顯示，db/db小鼠禁食12h后其肝組織SelS的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加。db/db小鼠肝組織敲低SelS后會(huì)減小體重變化率和禁食血糖變化率，降低血清胰島素水平和HOMA-IR水平以及

4、改善胰島素耐量；SelS基因敲低通過IRS-1/Akt/GSK-3β和FoxO1途徑而增加肝糖原含量和抑制糖異生；SelS基因敲低后顯著減少肝組織油紅O染色以及TG和CHO含量，降低了血清TG、FFA、ALT和AST水平；SelS基因敲低后抑制肝組織脂肪生成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量和促進(jìn)脂肪酸分解（FAO）關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量，而肝組織脂肪酸組成種類變化不大；SelS基因敲低后升高了肝組織AMPK和ACC磷酸化水平以及血清脂聯(lián)素的水平，降低了J

5、NK的磷酸化水平，減少了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，降低了血清TNF-α和IL-6的水平，其激活A(yù)MPK的機(jī)制可能與增加AMP/ATP比值和ADP/ATP比值有關(guān)。以上結(jié)果表明，SelS基因敲低可以緩解db/db小鼠肝脂肪變性和IR狀態(tài)，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK有關(guān)。
　?。?）應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)、qRT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡等方法研究SelS基因敲低對(duì)于DIO小鼠糖脂代謝的影響。結(jié)果顯示，DIO小鼠禁食12h后其肝組織SelS蛋白表達(dá)量增

6、加。DIO小鼠肝組織敲低SelS后會(huì)降低禁食血糖水平、血清胰島素水平和HOMA-IR水平以及改善葡萄糖耐量、胰島素耐量和丙酮酸耐量；SelS基因敲低抑制JNK磷酸化水平和升高胰島素信號(hào)通路中關(guān)鍵分子Akt磷酸化水平，降低了血清TNF-α和IL-6的水平；SelS基因敲低后顯著減少肝組織油紅O染色以及TG和CHO含量，降低了血清TG、FFA、ALT和AST水平；SelS基因敲低后升高了DIO小鼠肝組織AMPK和ACC的磷酸化水平，升高了血

7、清脂聯(lián)素的水平。以上結(jié)果表明，SelS基因敲低可以緩解DIO小鼠肝脂肪變性和IR狀態(tài)，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK有關(guān)。
　　（3）應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)、qRT-PCR法、蛋白質(zhì)印跡和HPLC等方法研究SelS基因敲低對(duì)于FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性的影響。結(jié)果顯示，SelS敲低后能升高AMPK和ACC的磷酸化水平，減少油紅O染色和肝細(xì)胞TG含量，抑制脂肪生成相關(guān)酶的基因表達(dá)，促進(jìn)FAO相關(guān)酶的基因表達(dá)；且這些作用均能夠被AMP

8、K的抑制劑Compound C或siRNA干擾序列所逆轉(zhuǎn)。AMPK的siRNA干擾序列還顯著降低了SelS敲低后升高的細(xì)胞耗氧量。而且，SelS敲低后能增加AMP/ATP的比值和ADP/ATP的比值。以上結(jié)果表明，在FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性的模型中，SelS基因敲低后至少部分地通過增加AMP/ATP的比值和ADP/ATP的比值而激活A(yù)MPK來抑制脂肪生成，促進(jìn)脂肪酸氧化分解從而緩解肝細(xì)胞脂肪變性。這也驗(yàn)證了DIO小鼠肝組織敲低S

9、elS后激活A(yù)MPK而緩解肝脂肪變性的現(xiàn)象和db/db小鼠肝組織特異性敲低SelS后至少部分地通過增加AMP/ATP的比值和ADP/ATP的比值而激活A(yù)MPK來抑制脂肪生成，促進(jìn)脂肪酸氧化分解從而緩解肝細(xì)胞脂肪變性的作用規(guī)律。
　?。?）應(yīng)用qRT-PCR法測(cè)定db/db小鼠與正常小鼠肝組織和胰腺組織中各種硒蛋白基因表達(dá)量。結(jié)果顯示，測(cè)定出db/db小鼠與正常小鼠肝組織中23種硒蛋白的基因表達(dá)量（Dio2未檢測(cè)出），其中14種硒蛋