柔嫩艾美耳球蟲肌動蛋白和肌動蛋白解聚因子基因的克隆表達和功能初步的研究.pdf

1、雞球蟲為孢子蟲綱、真球蟲目、艾美耳科、艾美耳屬的一類，是嚴格的細胞內(nèi)寄生蟲，每年都造成養(yǎng)雞業(yè)巨大經(jīng)濟損失。其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是主要的雞球蟲之一，寄生于雞盲腸內(nèi)，引起雞血便，死亡和飼料利用率降低。E. tenella和其它頂復門寄生蟲一樣能依賴于肌動蛋白骨架有效而且快速地入侵宿主細胞。肌動蛋白骨架包括肌動蛋白(actin)家族和肌動蛋白相關(guān)蛋白(actin related proteins，ARPS)家族

2、。肌動蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)是肌動蛋白相關(guān)蛋白的一類，廣泛存于真核細胞中的肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，通過切斷肌動蛋白纖絲和增加肌動蛋白纖絲解聚作用來重塑細胞骨架，進而影響細胞生長、運動、凋亡及胚胎發(fā)育等重要生理功能。本研究以：Etactin和ADF為對象，在國內(nèi)外首次初步探討其在球蟲細胞入侵中的作用，主要研究成果如下： 1.E. tenella ADF基因的克隆和表達通過PCR首次

3、克隆獲得了EtADF基因，其ORF序列長354bp，編碼118個氨基酸，預測分子量為13.14kDa；表達融合蛋白分子量為33.14kDa；純化得到了可溶性ADF，并且獲得了抗體滴度為1：5120的兔抗ADF多克隆抗體。克隆獲得了E. tenella和E necatrix ADF基因組序列，比較兩種序列發(fā)現(xiàn)，EtADF基因組和EnecatrixADF基因組相似性為92.5％，差異主要位于內(nèi)含子部位，而編碼區(qū)僅有4個核甘酸不同。通過DNA

4、star軟件包中的Megalign程序計算序列相似性，結(jié)果表明EtADF和T．godnii ADF相似性最高為69.1％，而與其它物種的ADF序列相似性都低于36.4％。進化分析結(jié)果表明EtADF和T．gondii ADF位于進化樹同一分支上。在結(jié)構(gòu)上EtADF具有與其它真核生物相似高度保守的a螺旋和β折疊構(gòu)構(gòu)象；與酵母cofilin比較，EtADF具有actin單體結(jié)合的位點，但是缺失與actin纖絲結(jié)合的a螺旋序列。EtADF沒有信

5、號肽序列，沒有核定位信號序列，有Ser3磷酸化位點。實驗表明EtADF能夠結(jié)合Etactin單體。 2.EtADF表達動態(tài)、EtADF和actin細胞定位分析在mRNA和蛋白水平研究了EtADF和Etactin在E. tenella不同生活階段的表達動態(tài)。首先通過RT-PCR和Southern blot證實了EtADF和Etactin mRNA在球蟲子孢子、裂殖子、未孢子化卵囊和孢子化卵囊都有所表達。Northern blot證明了在球

6、蟲子孢子、裂殖子、未孢子化的卵囊和孢子化的卵囊中只存在一種EtADF和Etactin mRNA．剪切形式。然后用real-time q-PCR檢測艾美耳球蟲不同生活階段ADF tuRNA表達量，結(jié)果顯示ADF mRNA在未孢子化和孢子化卵囊中表達量均顯著低于在子孢子和裂殖子中的表達量。Dot Blot實驗表明，Etactin在E. tenella不同生活階段蛋白質(zhì)表達水平相似；而未孢子化卵囊和孢子化卵囊中ADF蛋白質(zhì)表達量顯著低于子孢子

7、和裂殖子中ADF蛋白質(zhì)表達量。這些結(jié)果表明E. tenella不同生活階段ADF表達可能是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)。熒光定位發(fā)現(xiàn)，EtADF和Etactin分布于整個子孢子細胞內(nèi)，但是它們主要位于子孢子細胞膜附近。細胞松弛素B能夠改變子孢子Etactin分布情況，使其均勻分布于細胞內(nèi)。 3.Etaetin基因的克隆和表達通過PCR首次克隆獲得了E. tenella的actin基因，其ORF大小為1128bp，編碼376個氨基酸，預測分子

8、量為42.7kDa：表達融合蛋白分子量為62.7 kDa；純化得到了可溶性actin，并且獲得了抗體滴度為1：5120小鼠抗actin多克隆抗體。通過DNAstar軟件包中的Megalign程序計算序列相似性，結(jié)果表明Etactin和T．godnii actin的相似性最高，達到95.7％，Etactin和其它序列的相似性都大于83.0％。使用Phylip3.67對寄生蟲actin氨基酸序列進行進化分析，其結(jié)果表明Etactin和T．g

9、ondii actin位于進化樹同一分支上?？臻g結(jié)構(gòu)模擬表明Etactin的三維結(jié)構(gòu)可分為外部結(jié)構(gòu)域和內(nèi)部結(jié)構(gòu)域，又可以細分為4個亞結(jié)構(gòu)域(亞結(jié)構(gòu)域1-4)，與ADF結(jié)合的位點主要位于亞結(jié)構(gòu)域1和3上。Etactin具有和ATP/ADP結(jié)合位點；亞結(jié)構(gòu)域2中存在一個DNase Ⅰ結(jié)合環(huán)。 　　4.雞腎細胞培養(yǎng)和球蟲子孢子入侵雞腎細胞研究分析以培養(yǎng)雞腎原代細胞為模型研究Etactin和EtADF在宿主細胞入侵中功能機制。以抗子孢子裂解抗

10、原，抗重組EtADF和Etactin的多克隆抗體與子孢子同時加入細胞培養(yǎng)也液中共同培養(yǎng)，結(jié)果表明，兔抗子孢子裂解抗原的多克隆抗體能夠阻斷E. tenella子孢子入侵細胞；而小鼠抗actin多克隆抗體和兔抗ADF多克隆抗體完全不能阻斷Etenella子孢子入侵細胞。不同劑量的細胞松弛素B和LY294002在體外都能顯著抑制E.tenella子孢子入侵雞腎細胞，而lavendustin C在高劑量時才能顯著抑制子孢子入侵雞腎細胞；ML-7