雞毒支原體丙酮酸脫氫酶的生物學(xué)功能研究和隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變方法的建立.pdf

1、雞毒支原體（Mycoplasma Gallisepticum，MG）屬于支原體目、支原體科、支原體屬，是禽類重要病原體之一。雞毒支原體可感染雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉、火雞、家雀等多種禽類，主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀。雞群感染雞毒支原體后除表現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、流淚、啰音、呼吸困難等癥狀外，還可導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率下降，種蛋孵化率降低，肉雞生長(zhǎng)發(fā)育受阻，飼料轉(zhuǎn)化率降低。該病發(fā)病率極高，幾乎100％的雞場(chǎng)都有此病，雞場(chǎng)一旦感染就很難徹底清除，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的

2、損失。并且，雞毒支原體的感染可使雞群對(duì)其它病原微生物如大腸桿菌、禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒等的易感性增加，導(dǎo)致混合或繼發(fā)感染，引起更為嚴(yán)重的呼吸道綜合征，從而使損失加劇。丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase）是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的其中的一個(gè)酶，是關(guān)鍵的限速酶。已經(jīng)有研究表明，支原體參與代謝的酶類如烯醇化酶（enolase），甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，丙酮酸激酶（pyruvate kina

3、se，PK），除了自身的催化功能外，還可以作為毒力因子參與致病的作用。目前在雞毒支原體中的的丙酮酸脫氫酶的功能尚不清楚，本文將開展其生物學(xué)功能研究。另外本研究成功構(gòu)建了雞毒支原體隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座載體，利用該載體進(jìn)行了隨機(jī)突變，建立了隨機(jī)突變庫(kù)。
　　1.丙酮酸脫氫酶的生物學(xué)功能研究
　　根據(jù)GenBank中雞毒支原體Rlow株的序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過PCR方法獲得了雞毒支原體丙酮酸脫氫酶α亞基和β亞基的基因。將其克隆至pGE

4、M-T easy，測(cè)序并完成點(diǎn)突變后，將pdha和pdhb分別克隆至pET28a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pdha和pET-pdhb。分別將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下成功獲得表達(dá)融合蛋白His-PDHA和His-PDHB，大小分別為34kDa和41kDa。純化蛋白后對(duì)其進(jìn)行酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示該酶的單個(gè)亞基不具有酶活性，將兩種酶混合后再體外具有催化功能，活性稍低于標(biāo)準(zhǔn)品。將純化后的表達(dá)產(chǎn)物(His-P

5、DHA和His-PDHB)免疫小鼠制備了PDHA和PDHB抗血清，并通過Western-blot和ELISA驗(yàn)證了表達(dá)蛋白的免疫原性。Western-blot顯示PDHA和PDHB多抗血清可與提取的雞毒支原體膜蛋白發(fā)生特異性結(jié)合;說(shuō)明雞毒支原體膜表面有PDHA和PDHB。同時(shí)展示在大腸桿菌膜表面的PDHA和PDHB的重組菌株可以黏附禽DF1細(xì)胞。細(xì)胞黏附試驗(yàn)表明His-PDHA和His-PDHB鼠多抗對(duì)DF1細(xì)胞的黏附阻斷率為30.8％

6、和45％。補(bǔ)體殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明His-PDHB和His-PDHB多抗血清具有良好的殺菌作用。
　　2.雞毒支原體隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變?cè)泽w的構(gòu)建
　　為研究雞毒支原體中重要蛋白與毒力的關(guān)系。本研究擬構(gòu)建mini-Tn4001SpGm隨機(jī)轉(zhuǎn)座插入載體。該轉(zhuǎn)座子具備以下特征:含慶大霉素抗性基因，由螺原體螺旋啟動(dòng)子啟動(dòng)抗性基因的表達(dá);抗性基因兩側(cè)為含Inner和Outer的IS256插入重復(fù)區(qū);重復(fù)區(qū)之外為金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座酶基因。通過對(duì)隨