玉米內(nèi)生細菌的分離鑒定及抗真菌活性物質(zhì)的研究.pdf

1、分類號：Q窆3里：里2密級：公玨單位代碼：學號：100862009109玉米內(nèi)生細菌的分離鑒定及抗真菌活性物質(zhì)的研究IdentificationandAntifungalActivitySubstancesofEndophyticBacteriafromMaize學位申請人：候美玲指導教師：董金皋教授郝志敏副教授學科專業(yè)：微生物與生化藥學學位類別：理學碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學答辯日期：二。一二年五月二十九日摘要玉米大斑病是重要的玉米葉

2、部病害之一，引起該病的病原菌為玉米大斑病菌(SetDs力辦口Pr砌turcica)，嚴重發(fā)生時會極大地影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前防治大斑病主要是利用抗病品種，并輔以適當?shù)乃巹┓乐?。但由于抗病品種的單一大面積應用往往導致抗性迅速喪失，化學藥劑使用又常常帶來嚴重的負面影響。因此，尋求新的病害防治途徑勢在必行。利用植物內(nèi)生菌對植物病害進行生物防治具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，本研究從健康玉米植株?nèi)分離得到22株內(nèi)生細菌，進一步篩選得到1株對玉米大斑病菌

3、具有拮抗作用的內(nèi)生細菌YYl菌株，經(jīng)對其生物學特性、抗菌性能、抗菌物質(zhì)及抗菌機理進行分析與研究，獲得以下主要結(jié)果：1從健康玉米葉片中分離出的1株對玉米大斑病菌具有較好拮抗作用的內(nèi)生細菌菌株～YYl，該菌株有較廣的抗菌譜，通過分生孢子懸浮液噴霧法檢測YYl菌株的生防效果，發(fā)現(xiàn)濃度為2104個／mL的孢子懸浮液與YYl菌株發(fā)酵液等比例混合液，對玉米大斑病菌具有較好的抑制作用。通過形態(tài)觀察，生理生化反應及16SrDNA基因序列比對，鑒定YYl

4、菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。2研究了YYl菌株的最佳發(fā)酵條件，即可溶性淀粉30％、蛋白胨20％、KH2P04002％、MnCl2001％，培養(yǎng)基初始pH90，培養(yǎng)基裝液量30mL／250mL，接種量4％，28。C120rpm搖床振蕩培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵液對玉米大斑病菌的抑菌活性在30h時幾乎升高1倍。3對YYl菌株分泌的抗菌蛋白粗提液的抑菌機理進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)粗蛋白處理后致使玉米大斑病菌

5、基內(nèi)菌絲由絲狀變?yōu)榇闋?；當粗蛋白濃度為O78∥此時，分生孢子萌發(fā)完全受抑制，原生質(zhì)體裂解。孢子萌發(fā)和菌絲生長過程中，cAMP信號途徑相關(guān)基因表達降低，且相關(guān)基因突變菌株抑制率亦降低，推測抑菌的分子機理可能與cAMP信號途徑有關(guān)。4抗菌粗蛋白對熱穩(wěn)定，對蛋白酶不敏感，重金屬Cr3可使蛋白完全失活，并且pH活性范圍較寬，在pH6～11范圍內(nèi)抑菌活性強，在堿性條件下穩(wěn)定，在強酸性條件下抑菌活性幾乎消失。粗蛋白經(jīng)分離純化并進行SDSPAGE檢

6、測得到單一蛋白條帶YYl036，分子量約為30kD，經(jīng)MALDITOFMS分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與烯酰輔酶A水解酶(enoylCoAhydratase)的匹配度最高。5采用高速逆流色譜(HSCCC)對菌株YYl分泌的脂肽類抗菌物質(zhì)進行分析，確定HSCCC最佳條件：檢測波長為214nin，溶劑體系為乙酸乙酯：正丁醇：水(4：1：5)。經(jīng)HSCCC后生測發(fā)現(xiàn)第9個組分對玉米大斑病菌有很強的抑菌活性，該組分的保留時間為113～115min，進一步經(jīng)H