PCSK6對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞生物學(xué)的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:1.探討siRNA沉默PCSK6基因?qū)δz原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)生物學(xué)行為的影響。2.探討外源性 PCSK6重組蛋白對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:1.采用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠CIA模型，取膝關(guān)節(jié)滑膜組織原代培養(yǎng)FLS；采用人工合成的大鼠PCSK6特異siRNA特異性抑制PCSK6在CIA FLS中的表達(dá)，以negative siRNA為陰性對(duì)照組，瞬時(shí)

2、轉(zhuǎn)染24 h、36 h，采用RT-qPCR法檢測(cè)抑制效率，同時(shí)檢測(cè)PCSK6基因沉默后各相關(guān)基因的表達(dá)；采用MTT、Transwell、細(xì)胞劃痕、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法檢測(cè)干擾PCSK6表達(dá)后對(duì)大鼠CIA FLS增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期和相關(guān)炎性因子分泌的影響。2.采用PCSK6重組蛋白誘導(dǎo)RA FLS，采用MTT、Transwell、細(xì)胞劃痕、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法檢測(cè)PCSK6重組蛋白對(duì)RA FLS增殖、侵襲、遷移、細(xì)

3、胞周期和凋亡以及相關(guān)炎性因子分泌的影響；采用RT-qPCR法檢測(cè)PCSK6重組蛋白刺激后各相關(guān)基因的表達(dá)；采用Western blot法檢測(cè)PCSK6重組蛋白對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9以及ERK、STAT3、Wnt3a、Nodal、mTOR、NF-κB p65、NF-κB p105/p50信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。采用通路抑制劑PD98059、Stattic、PDTC分別抑制ERK、STAT3、NF-κB p65通路，與PCSK6重組蛋白共同作

4、用于RA FLS，利用MTT、Transwell、細(xì)胞劃痕、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法檢測(cè)ERK、STAT3、NF-κB p65通路抑制劑對(duì)PCSK6重組蛋白誘導(dǎo)的RA FLS增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期和凋亡以及相關(guān)炎性因子分泌的影響。
　　結(jié)果:1.轉(zhuǎn)染特異性siRNA-PCSK6后，干擾組與陰性對(duì)照組相比，PCSK6 mRNA水平明顯被抑制(P<0.001)，CIA FLS的增殖受到抑制(P<0.001)，細(xì)胞的侵襲和遷移能

5、力下降(P<0.001)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)分泌降低(P<0.001)，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目增多(P<0.05)，PCSK6下游基因 CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、MPZL2、IGF2、PADI4表達(dá)均明顯下降(P<0.05)。2. PCSK6重組蛋白誘導(dǎo)RA FLS后，與空白對(duì)照組相比，150ng/mL PCSK6重組蛋白促進(jìn)效果最顯著，能使RA FLS的增殖

6、速率顯著提高(P<0.01)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力加強(qiáng)(P<0.001)，IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α分泌均升高(P<0.05)，S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)增多(P<0.01)，細(xì)胞晚期凋亡率減少(P<0.01)，PCSK6下游基因C10ORF116、CXCL9、CXCL10、HIF-1α、IL-6、IL-10、IL-26、MMP9、NOSTRIN、TNF-α表達(dá)均明顯升高(P<0.001)，MMP9前體和成熟

7、的蛋白量均升高，誘導(dǎo)6h時(shí)可顯著激活FLS中的ERK、STAT3、NF-κB p65信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。加入通路抑制劑PD98059、Stattic和PDTC后，150ng/mL PCSK6重組蛋白誘導(dǎo)的RA FLS的增殖(P<0.05)、遷移(P<0.001)、侵襲(P<0.001)、炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α)分泌(P<0.05)均受到抑制；通路抑制劑Stattic和PDTC可以逆轉(zhuǎn)PCSK6重組蛋

8、白對(duì)細(xì)胞周期的誘導(dǎo)(P<0.05)；通路抑制劑PDTC可以逆轉(zhuǎn)PCSK6重組蛋白對(duì)FLS的細(xì)胞凋亡的影響(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.內(nèi)源性PCSK6基因沉默對(duì)CIA FLS的生物學(xué)行為具有一定抑制作用，為進(jìn)一步研究CIA發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。2.外源性PCSK6重組蛋白對(duì)RA FLS的增殖、遷移、侵襲和炎癥因子分泌等生物學(xué)行為具有一定促進(jìn)作用；PCSK6通過(guò)參與ERK、STAT3、NF-κB p65信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控RA FLS