結(jié)腸n-甲基-D-天冬氨酸受體參與腸易激綜合征內(nèi)臟高敏感發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究分兩個(gè)部分，對以上問題和假說進(jìn)行探討和驗(yàn)證。第一部分內(nèi)容探討NMDA受體在結(jié)腸黏膜中的表達(dá)改變及與內(nèi)臟高敏感癥狀的相關(guān)性，包括:1.IBS患者及健康對照者結(jié)腸黏膜NMDA受體的表達(dá)改變，及其表達(dá)水平與患者腹部癥狀的關(guān)聯(lián)性分析;2.內(nèi)臟高敏感小鼠模型的建立，小鼠結(jié)腸黏膜NMDA受體的表達(dá)水平、內(nèi)臟敏感性變化及二者的關(guān)聯(lián)性分析。第二部分內(nèi)容通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，探討結(jié)腸NMDA受體參與腸易激綜合征內(nèi)臟高敏感發(fā)生的可能機(jī)

2、制及信號通路，包括:1.使用動物實(shí)驗(yàn)，探討結(jié)腸黏膜NMDA受體活化之后是否會引起內(nèi)臟敏感性的相應(yīng)變化，并探討NMDA受體活化對BDNF和ERK通路蛋白的影響;2.使用體外培養(yǎng)的結(jié)腸細(xì)胞，進(jìn)一步對上述假說進(jìn)行驗(yàn)證，探索結(jié)腸NMDA受體活化之后可能的下游信號通路及蛋白變化。
　　方法：
　　第一部分
　　將體重為20-30g的雄性C57BL/6小鼠，使用TNBS進(jìn)行灌腸處理，建立內(nèi)臟高敏感動物模型。對照組小鼠使用同樣方法，

3、給予同等劑量的50％乙醇溶液灌腸。使用針對小鼠腸炎的疾病活動指數(shù)(DAI)對灌腸后小鼠腸炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。灌腸結(jié)束4周后，應(yīng)用結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)后小鼠腹部撤回反射(AWR)評分對小鼠內(nèi)臟敏感性進(jìn)行檢測。獲取小鼠結(jié)腸標(biāo)本，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，評估小鼠結(jié)腸組織學(xué)炎癥狀況。使用免疫組化及western blot對小鼠結(jié)腸黏膜NMDA受體表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并分析蛋白表達(dá)水平與內(nèi)臟敏感性AWR評分之間的關(guān)聯(lián)性。
　　第二部分

4、
　　取第一部分研究中TNBS灌腸造模之后的小鼠糞便，檢測糞便中NMDA受體潛在激動劑glutamate和ammonia的含量變化，并與對照組小鼠作對比。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.研究對象臨床資料
　　2.NR1蛋白在人結(jié)腸黏膜的表達(dá)
　　使用免疫組化技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，目的蛋白NR1在人結(jié)腸黏膜廣泛表達(dá)，主要表達(dá)在結(jié)腸上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞。
　　3.人結(jié)腸黏膜NR1的免疫組化定量分析及與

5、腹部癥狀之間的關(guān)聯(lián)性分析
　　在對照組、IBS患者組以及所有納入者組，結(jié)腸黏膜NR1表達(dá)量與腹痛/腹部不適癥狀嚴(yán)重程度評分之間均存在顯著關(guān)聯(lián)性（對照組:r=0.560，P=0.016; IBS組:r=0.522，P=0.001;所有納入者組:r=0.596，P＜0.001）。結(jié)腸黏膜NR1表達(dá)量與腹痛/腹部不適癥狀發(fā)作頻率之間在各分組中同樣存在顯著關(guān)聯(lián)性（對照組:r=0.568，P=0.014;IBS組:r=0.632，P＜0.0

6、01;所有納入者組:r=0.663，P＜0.001）。
　　4.人結(jié)腸黏膜NR1的western blot定量分析及與腹部癥狀之間的關(guān)聯(lián)性分析
　　關(guān)聯(lián)性分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在對照組、IBS患者組以及所有納入者組，結(jié)腸黏膜NR1表達(dá)量與腹痛/腹部不適癥狀嚴(yán)重程度評分之間均存在顯著關(guān)聯(lián)性（對照組:r=0.646，P=0.004; IBS組:r=0.586，P＜0.001;所有納入者組:r=0.669，P＜0.001)。結(jié)腸黏膜N

7、R1表達(dá)量與腹痛/腹部不適癥狀發(fā)作頻率之間在各分組中同樣存在顯著關(guān)聯(lián)性（對照組:r=0.649，P=0.004; IBS組:r=0.551，P＜0.001;所有納入者組:r=0.708，P＜0.001）。
　　5.內(nèi)臟高敏感小鼠模型的建立
　　在對小鼠進(jìn)行灌腸處理后，TNBS灌腸小鼠的DAI評分在灌腸之后第1至7天時(shí)最高，之后逐漸降低，第21天時(shí)評分降至為0，表明結(jié)腸炎癥恢復(fù)正常。灌腸處理后4周，顯微鏡下觀察到的HE染色結(jié)果

8、顯示，TNBS組和對照組小鼠均無顯著炎性表現(xiàn)。灌腸處理后4周，對兩組小鼠結(jié)直腸擴(kuò)張后的AWR評分進(jìn)行記錄，在15 mmHg擴(kuò)張壓力下，TNBS組和對照組小鼠的內(nèi)臟敏感性無顯著差異;但是，在30、45和60 mmHg擴(kuò)張壓力下，TNBS組小鼠的AWR評分顯著高于對照組小鼠，提示內(nèi)臟敏感性的升高。
　　6.NR1蛋白在小鼠結(jié)腸黏膜的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示，NR1蛋白表達(dá)散布于整個(gè)小鼠結(jié)腸黏膜標(biāo)本，其中在結(jié)腸上皮細(xì)胞和固有層細(xì)

9、胞表達(dá)豐富。
　　7.小鼠結(jié)腸黏膜NR1的免疫組化定量分析及與內(nèi)臟敏感性之間的關(guān)聯(lián)性分析
　　在TNBS組以及對照組小鼠，結(jié)腸黏膜NR1表達(dá)量與AWR評分之間存在顯著關(guān)聯(lián)性，尤其是45 mmHg（TNBS組小鼠:r=0.831，P=0.003;對照組小鼠:r=0.766，P＜0.01）和60 mmHg（TNBS組小鼠:r=0.668，P=0.035;對照組小鼠:r=0.875，P＜0.001）的結(jié)直腸擴(kuò)張壓力下。不考慮分組情

10、況不同而將兩組小鼠作為整體分析，結(jié)腸黏膜NR1表達(dá)量與AWR評分之間同樣存在顯著關(guān)聯(lián)性，尤其是在30 mmHg(r=0.741，P＜0.001)、45 mmHg(r=0.841，P＜0.001)和60 mmHg(r=0.738,P＜0.001)結(jié)直腸擴(kuò)張壓力下。
　　8.小鼠結(jié)腸黏膜NR1的western blot定量分析及與內(nèi)臟敏感性之間的關(guān)聯(lián)性分析
　　在TNBS組以及對照組小鼠，結(jié)腸黏膜NR1表達(dá)量與AWR評分之間存在

11、顯著關(guān)聯(lián)性，尤其是在30 mmHg(TNBS組小鼠:r=0.828，P=0.003;對照組小鼠:r=0.654，P=0.040)、45 mmHg(TNBS組小鼠:r=0.757，P=0.011;對照組小鼠:r=0.883，P＜0.001)的結(jié)直腸擴(kuò)張壓力下。不考慮分組情況不同而將兩組小鼠作為整體分析，在所有4個(gè)不同的結(jié)直腸擴(kuò)張壓力下，結(jié)腸黏膜NR1表達(dá)量與AWR評分之間均存在顯著關(guān)聯(lián)性(15 mmHg: r=0.524，P=0.018;

12、30 mmHg: r=0.826，P＜0.001;45 mmHg: r=0.843,P＜0.001;60 mmHg: r=0.641,P=0.002)。
　　第二部分
　　1.TNBS灌腸小鼠及對照組小鼠糞便中g(shù)lutamate和ammonia的含量測定
　　兩組小鼠糞便中g(shù)lutamate的含量并無顯著差異(17.4±0.1 nmol/g vs.17.7±0.1 nmol/g，P=0.085)，但是TNBS組小鼠糞便

13、中ammonia的含量顯著高于對照組小鼠(15.4±1.7μg/g vs.10.2±1.1μg/g，P=0.017)。
　　2.正常小鼠接受ammonia灌腸處理后內(nèi)臟敏感性變化
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ammonia灌腸處理能夠顯著增強(qiáng)小鼠的內(nèi)臟敏感性，特別是在30 mmHg和45 mmHg擴(kuò)張壓力下。而ammonia處理導(dǎo)致的內(nèi)臟敏感性的升高，能夠被預(yù)先使用的NMDA受體特異性拮抗劑MK801所拮抗。
　　3.

14、正常小鼠接受NMDA灌腸處理后內(nèi)臟敏感性變化
　　與對照組相比，在15 mmHg擴(kuò)張壓力下，NMDA（10 mg/kg）對小鼠的內(nèi)臟敏感性并無改變，但是，在30、45和60 mmHg擴(kuò)張壓力下，NMDA處理組小鼠顯示出對CRD更為強(qiáng)烈的反應(yīng)。分別預(yù)先使用MK801、U0126和TrkB/Fc對NMDA受體、ERK通路和TrkB（BDNF的特異性作用受體）進(jìn)行拮抗，均可顯著抑制NMDA處理引起的內(nèi)臟高敏感反應(yīng)。
　　4.正常小

15、鼠接受NMDA灌腸處理后結(jié)腸BDNF的表達(dá)改變和ERK通路的活化
　　NMDA處理組小鼠結(jié)腸黏膜的BDNF含量顯著高于對照組小鼠，MK801和U0126預(yù)處理均可顯著抑制此效應(yīng)。不同處理組小鼠結(jié)腸黏膜總的ERK含量并無差異，但是NMDA處理組小鼠結(jié)腸黏膜磷酸化的ERK(phosphorylated ERK，pERK)含量顯著高于對照組，而MK801和U0126預(yù)處理均可顯著抑制此效應(yīng)。
　　5.結(jié)腸上皮細(xì)胞NMDA受體活化后

16、上清中BDNF的分泌改變
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種拮抗劑均可顯著抑制NMDA引起的上清BDNF含量升高。
　　6.結(jié)腸上皮細(xì)胞NMDA受體活化后細(xì)胞中BDNF的表達(dá)改變和ERK通路的活化
　　Western blot結(jié)果顯示，結(jié)腸上皮細(xì)胞HT29接受50μM、100μM和200μMNMDA刺激之后，測得的細(xì)胞中BDNF的含量分別是對照組的1.47倍、2.43倍和2.60倍。使用MK801和U0126預(yù)處理能夠抑制此效應(yīng)。與對照

17、處理相比，NMDA刺激之后，結(jié)腸上皮細(xì)胞中總ERK的表達(dá)水平并無變化，但pERK表達(dá)水平呈現(xiàn)劑量依賴性增加。使用MK801和U0126預(yù)處理能夠抑制此效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　第一部分
　　1.人結(jié)腸黏膜廣泛表達(dá)NMDA受體，并且IBS患者中表達(dá)顯著升高，結(jié)腸黏膜NMDA受體表達(dá)量與腹痛、腹部不適癥狀評分呈顯著關(guān)聯(lián)性。
　　2.TNBS灌腸處理小鼠28天后可建立IBS樣內(nèi)臟高敏感動物模型，其結(jié)腸黏膜NMDA受體表達(dá)