敲除CHOP增加小鼠心肌梗死急性期死亡率且不能改善心肌梗死后心室重構(gòu).pdf

1、目的：
　　本課題旨在驗(yàn)證敲除CHOP在心肌梗死后心室重構(gòu)中的作用及其機(jī)制，為臨床上沒有條件或者錯(cuò)過接受再灌注治療的心肌梗死患者提供新的治療手段。
　　方法：
　　1.心肌梗死模型的建立
　　8-12周齡，體重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠，甲苯噻嗪(5 mg/kg)和氯胺酮(100 mg/kg)混合腹腔注射麻醉。經(jīng)胸骨左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟。以8-0絲線穿過左心耳下緣1-2 mm處的2/

2、3心肌層，永久結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈。手術(shù)過程中一直進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，以心電圖ST段抬高和心肌變白為判斷心肌梗死成功的標(biāo)準(zhǔn)，心肌梗死成功后關(guān)閉胸腔，使心肌永久缺血28天。假手術(shù)的制作過程相似但無需結(jié)扎冠狀動脈。
　　2.心肌缺血/再灌注模型建立
　　8-12周齡，體重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠，甲苯噻嗪(5 mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。經(jīng)胸骨左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟。以8-0絲線

3、帶針線穿過左心耳下緣1-2 mm處的2/3心肌層，針尾套入珠子后短暫結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈誘導(dǎo)心肌缺血45分鐘后解除結(jié)扎使其再灌注7天。手術(shù)過程中一直進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，心電圖ST段視作缺血成功的標(biāo)志，去除珠子后ST段下降視作再灌注成功標(biāo)志。假手術(shù)僅需套入珠子而無需結(jié)扎冠狀動脈。
　　3.生存分析
　　用8-12周齡，體重20-25g的CHOP基因敲除小鼠和野生型雄性小鼠制作心肌梗死模型，實(shí)驗(yàn)分為4組:野生型+假手術(shù)組、野生型+心肌梗死

4、組、基因敲除+假手術(shù)組以及基因敲除+心肌梗死組。觀察和記錄4周內(nèi)小鼠的生存率和死亡原因。
　　4.心肌梗死面積測量
　　為評價(jià)敲除CHOP對心肌梗死小鼠心肌梗死程度的影響，我們于心肌梗死術(shù)后3-12小時(shí)內(nèi)戊巴比妥鈉過量麻醉脫臼處死小鼠，心臟取材，-20℃冰凍后切片做TTC染色測量心肌梗死面積。實(shí)驗(yàn)分為野生型+心肌梗死組、基因敲出+心肌梗死組。被紅染的部分為正常組織，白色部分為壞死組織，心肌梗死面積(％)=梗死區(qū)域面積/左心室

5、面積×100％。
　　5.超聲心動圖檢查
　　小鼠心梗模型制備4周后用心臟超聲儀測量左室內(nèi)徑和功能，分為野生型+假手術(shù)組、野生型+心肌梗死組、基因敲除+假手術(shù)組、基因敲除+心肌梗死組。清醒狀態(tài)下固定小鼠，左側(cè)胸部脫毛后，二維超聲定位，M超測量舒張期左室前后壁厚度(LVAWd和LVPWd)，左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)和左室收縮末內(nèi)徑(LVESd)，進(jìn)而測量左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF): LVFS(％)=

6、(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100％, LVEF(％)=[(LVEDv-LVSv)/LVEDv]×100％。超聲檢查后，將小鼠以0.5％戊巴比妥鈉過量(100mg/kg)麻醉頸椎脫臼處死，稱量心臟重量和肺重量以計(jì)算心重體重比和肺重體重比。
　　6.創(chuàng)傷性左室血流動力學(xué)檢查
　　小鼠心梗模型制備4周后檢測小鼠左室血流動力學(xué)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)分為野生型+假手術(shù)組、野生型+心肌梗死組、基因敲除+假手術(shù)組、基因敲除+心肌梗死組。

7、甲苯噻嗪和氯胺酮復(fù)合麻醉，氣管插管，機(jī)械通氣。顯微鏡下右側(cè)頸總動脈置入米勒導(dǎo)管(Millar導(dǎo)管)，輕輕送入左心室，測量心率(HR)，左室收縮壓(LVSP)，左室舒張末壓(LVEDP)，并通過PowerLab軟件程序計(jì)算左室壓力最大、最小變化率(dp/dt max，dp/dt min)和指數(shù)的弛豫時(shí)間常數(shù)(τ)。
　　7.TUNEL染色和Masson染色
　　我們通過TUNEL染色和Masson染色評價(jià)敲除CHOP對心肌細(xì)胞

8、凋亡和心肌纖維化的影響，實(shí)驗(yàn)分為野生型+心肌梗死組、基因敲出+心肌梗死組、野生型+缺血/再灌注組、基因敲出+缺血/再灌注組。其中小鼠心肌梗死4周，缺血/再灌注7天過量麻醉脫臼處死取材，4％多聚甲醛固定固定后石蠟包埋切片后做TUNEL染色和Masson染色。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　SPSS16.0測量統(tǒng)計(jì)顯著性差異，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。三組以上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異用ANOVA檢驗(yàn)，組間差異用Bonferro

9、ni氏法校正。整體生存狀況用Kaplan-Meier生存分析，組間比較用對數(shù)秩檢驗(yàn)。P＜0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.敲除CHOP增加小鼠心肌梗死死亡率
　　選取經(jīng)過基因鑒定的8-10周齡，雄性，體重約20-25 g的CHOP基因敲除小鼠及其野生型小鼠制作心肌梗死模型。模型制作成功后每天觀察2次，早晚各1次，及時(shí)發(fā)現(xiàn)死亡小鼠并行尸檢確定死亡原因，詳細(xì)記錄和統(tǒng)計(jì)分析小鼠的生存情況和死亡原因。心肌梗死4

10、周CHOP基因敲除小鼠心梗死亡率顯著高于野生型小鼠(68％ vs38.5％，P＜0.05)，說明敲除CHOP增加小鼠永久性心肌梗死死亡率。
　　2.敲除CHOP對小鼠心肌梗死面積沒有影響
　　敲除CHOP會增加小鼠心肌梗死死亡率，那么敲除CHOP對心肌梗死程度的影響如何呢？我們選取經(jīng)過基因鑒定的8-10周齡，雄性，體重約20-25 g的CHOP基因敲除小鼠及其野生型小鼠制作心肌梗死模型。模型制作成功后3-12小時(shí)內(nèi)0.5％戊

11、巴比妥鈉過量麻醉脫臼處死小鼠，摘取心臟-20℃冷凍后切片行TTC染色測量心肌梗死面積。研究發(fā)現(xiàn)敲除CHOP基因敲除小鼠與其野生型小鼠的心肌梗死面積相似(45.7％ vs47.3％，P=0.54)，說明敲除CHOP不能減小小鼠心肌梗死面積。
　　3.敲除CHOP對小鼠心肌梗死心室重構(gòu)和心功能沒有影響
　　既然敲除CHOP對小鼠心梗面積沒有影響，那么敲除CHOP對心肌梗死后心室重構(gòu)和心功能有什么影響呢？我們選取心肌梗死后4周的小

12、鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查評價(jià)心室重構(gòu)程度和心功能。處死小鼠稱取心肺重量評價(jià)永久性心肌梗死對心肺形態(tài)的影響。結(jié)果表明心肌梗死4周，CHOP敲除基因鼠與野生型小鼠相比較，除了左室前壁厚度(LVAWd)顯著增厚之外，左室后壁厚度(LVPWd)、左心室舒張末直徑(LVEDd)和左室收縮末內(nèi)徑(LVEDs)二組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。左心室收縮功能方面，左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)兩組間也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而與接受假手術(shù)的小鼠相比，C

13、HOP敲除基因鼠和野生型小鼠有相似的改變:左心室顯著擴(kuò)大（LVESd和LVEDd增加），LVFS和LVEF顯著下降。而另一方面，無論CHOP敲除組還是野生型組小鼠心肌梗死對心肺重量沒有顯著影響。這些結(jié)果說明敲除CHOP不能改善心肌梗死后心室重構(gòu)和心功能。
　　4.敲除CHOP對小鼠心肌梗死左心室血流動力學(xué)沒有影響
　　超聲水平驗(yàn)證敲除CHOP對心肌梗死心室重構(gòu)和心功能的影響后我們接著驗(yàn)證敲除CHOP對小鼠心肌梗死血流動力學(xué)的

14、影響。同樣，我們選取心梗模型后4周小鼠行有創(chuàng)血流動力學(xué)檢查。置入millar導(dǎo)管后連接Powlaber系統(tǒng)測量血流動力學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明與接受假手術(shù)的小鼠相比，接受心肌梗死手術(shù)4周的小鼠，無論左室收縮壓(LVSP)、左室壓力最大、最小變化率(dp/dt max，dp/dtmin)、左室收縮力（contractility）以及左室舒張末壓力(LVEDP)指數(shù)弛豫時(shí)間常數(shù)(τ)顯著下降，然而CHOP基因敲除組與野生型組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這

15、些結(jié)果表明敲除CHOP不能改善心肌梗死后左心室血流動力學(xué)狀態(tài)。
　　5.敲除CHOP對小鼠心肌梗死心肌細(xì)胞凋亡水平和心肌纖維化程度沒有影響
　　上述結(jié)果表明敲除CHOP對小鼠心肌梗死后心臟形態(tài)學(xué)和功能學(xué)都沒有影響，接下來我們在組織學(xué)水平驗(yàn)證CHOP對小鼠心肌梗死的影響。小鼠心肌梗死4周心臟取材固定、石蠟包埋切片后做TUNEL染色和Masson染色檢測心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化。結(jié)果顯示心肌梗死4周，CHOP敲除小鼠和野生型小鼠

16、的心肌梗死區(qū)被纖維瘢痕組織取代，兩組的陳舊心梗面積（纖維化）和交界區(qū)心肌纖維化程度沒有顯著差異，CHOP敲除小鼠心肌細(xì)胞凋亡較野生型小鼠無顯著差異。
　　6.敲除CHOP對小鼠心肌缺血/再灌注心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化的影響
　　上述研究表明敲除CHOP增加永久性心肌梗死的死亡率，不能減輕心室重構(gòu)和心功能損害，而大量文獻(xiàn)報(bào)道敲除或下調(diào)CHOP表達(dá)對小鼠心肌缺血/再灌注損傷有利。有鑒于此，我們進(jìn)一步研究了敲除CHO

17、P對小鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響。心肌缺血45分鐘，再灌注24小時(shí)處死小鼠做心臟TTC染色測量心肌梗死面積;心肌缺血45分鐘，再灌注7天處死小鼠心臟組織切片做TUNEL染色和Masson染色。我們發(fā)現(xiàn)CHOP敲除組(KO)心梗面積較野生型小鼠(WT)顯著減小，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(29.83％ VS17.34％，P＜0.05);敲除CHOP也能顯著減輕小鼠缺血/再灌注損傷心肌纖維化(23.0％ VS16.0％，P＜0.05)和心肌細(xì)胞凋亡(0