水稻SNARE蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物。在一些水稻產(chǎn)區(qū)，病原菌、高鹽、干旱等逆境脅迫嚴(yán)重影響了水稻的生長(zhǎng)和生產(chǎn)，因此闡明植物耐受逆境脅迫的分子機(jī)制和改良植物的抗逆性已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)研究的主要目標(biāo)之一。本論文的主要研究?jī)?nèi)容分為兩個(gè)方面：一、從水稻中分離了4個(gè)與植物逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的SNARE蛋白家族基因，并對(duì)它們的功能進(jìn)行了初步研究；二、采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了水稻抗稻瘟病質(zhì)膜相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。
　　 真核生物細(xì)胞囊泡運(yùn)輸過(guò)程

2、中的膜融合主要是由SNARE蛋白介導(dǎo)的，SNARE蛋白的結(jié)構(gòu)高度保守。研究發(fā)現(xiàn)，植物中的SNARE蛋白促進(jìn)植物細(xì)胞板形成，能與離子通道蛋白相互作用，有利于植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，能提高植物的抗病性及參與植物的向重力性作用。本研究從水稻中克隆了水稻中的SNAP25類(lèi)蛋白基因OsSNAP32，并對(duì)其功能進(jìn)行初步研究。OsSNAP32基因編碼蛋白含有283個(gè)氨基酸，在N端和C端分別存在一個(gè)Qb-SNARE結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Qc-SNARE結(jié)構(gòu)域。洋蔥表

3、皮瞬時(shí)表達(dá)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，OsSNAP32基因的編碼蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。半定量RT-PCR的結(jié)果表明，該基因的表達(dá)受到H2O2、PEG6000、SA、ABA、冷、熱、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和白葉枯病菌（Xanthomonas campestris pv.vesicator）這8種脅迫處理的誘導(dǎo)。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行稻瘟病菌接種處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義OsSNAP32基因植株的抗瘟性與對(duì)照相比明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)反義Os

4、SNAP32基因植株的抗瘟性與對(duì)照相比無(wú)明顯變化。綜上研究結(jié)果表明OsSNAP32基因在水稻各種脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 本研究還克隆了Qb-SNARE蛋白家族成員基因OsNPSN11～13，這3個(gè)基因的序列同源性為80％-85％，具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，均含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，分別定位于水稻第6、3和7條染色體上，多重序列比對(duì)結(jié)果表明這3個(gè)基因與擬南芥的AtNPSN11～13基因的同源性較高，所編碼的蛋白

5、均含有一個(gè)Qb-SANRE結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，這3個(gè)基因均定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。將OsNPSN11基因構(gòu)建到表達(dá)載體pET-30a中進(jìn)行原核表達(dá)，并進(jìn)一步得到純化蛋白制備多克隆抗體，用該抗體與水稻細(xì)胞的不同提取組分進(jìn)行Western blot，結(jié)果表明該基因的編碼蛋白定位于質(zhì)膜上。
　　 為了研究水稻中OsNPSN11～13這3個(gè)基因的功能，我們用半定量RT-PCR的方法分析這3個(gè)基因在H2O

6、2、NaCl和PEG6000處理下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)OsNPSN11～12基因在用H2O2進(jìn)行處理時(shí)表達(dá)量均有所增加，而在用NaCl和PEG6000處理時(shí)，OsNPSN11～12基因的表達(dá)量有所下降，OsNPSN13基因的表達(dá)在各種處理情況下變化并不明顯。進(jìn)一步研究基因的功能，將這3個(gè)基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中，對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞和對(duì)照酵母細(xì)胞進(jìn)行H2O2、NaCl和甘露醇處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在固體培養(yǎng)基上還是液體培養(yǎng)基上，在用H2O2進(jìn)行處

7、理時(shí)，轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞比對(duì)照酵母細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)好，而在用NaCl弄口甘露醇進(jìn)行處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞比對(duì)照酵母細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)差表現(xiàn)為更加敏感。為進(jìn)一步研究基因在植物中的功能，將基因轉(zhuǎn)入煙草中，T1代轉(zhuǎn)基因幼苗在1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行H2O2、Nacl和甘露醇處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2處理后，轉(zhuǎn)基因煙草比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵蓍L(zhǎng)勢(shì)好，用NaCl和甘露醇處理后，轉(zhuǎn)基因煙草比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵蓍L(zhǎng)勢(shì)差。由上可知，OsNPSN11～13可能參與酵母和煙草的抗H2O2脅迫過(guò)

8、程，而在NaCl和甘露醇脅迫過(guò)程中可能不起作用。
　　 進(jìn)一步分析OOsNPSN11～13這3個(gè)基因在抵御生物脅迫過(guò)程中的功能。通過(guò)半定量RT-PCR的方法分析了水稻植株在接種白葉枯病菌和稻瘟病菌處理后的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在白葉枯病菌接種處理后，OsNPSN11～12基因的表達(dá)受到誘導(dǎo)，在稻瘟病菌接種處理后，抗病品種黑殼子粳中OsNPSN11～12基因的表達(dá)受到誘導(dǎo)，感病品種蘇御糯中OsNPSN11～12基因的表達(dá)在處理前后沒(méi)有明顯

9、變化，OsNPSN13基因的表達(dá)在兩種病原菌處理前后均沒(méi)有明顯變化。鑒于OsNPSN11～12基因在抗稻瘟病品種和感病品種中的表達(dá)差異，我們將OsNPSN11基因轉(zhuǎn)化感病品種蘇御糯受體，對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR、RT-PCR和Southern blot檢測(cè)得到陽(yáng)性植株后，對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行苗期抗瘟性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義OsNPSN11基因植株的抗性明顯增強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OsNPSN11基因在水稻植株抗病過(guò)程中起著一定的作用

10、，具體的抗病機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。
　　 植物質(zhì)膜蛋白在植物抵御病原物侵染早期信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要的作用。本文采取改進(jìn)的質(zhì)膜蛋白提取、純化和雙向電泳方法，分析了太湖流域地方抗病品種黑殼子粳在稻瘟病菌菌株北1接種處理前后質(zhì)膜相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。比較分析了未處理和接種處理8h和24h后質(zhì)膜蛋白的雙向電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)有23個(gè)蛋白點(diǎn)受到了不同程度地誘導(dǎo)，并對(duì)這23個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，其中7個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS

11、）結(jié)果表明這23個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白可分為四類(lèi)：1）與植物生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶類(lèi)，如與植物糖酵解相關(guān)的丙糖磷酸異構(gòu)酶（TIM）、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPD），與脂類(lèi)代謝相關(guān)的烯酰CoA水合酶（ECH），與能量代謝相關(guān)的蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）、乙醇脫氫酶（ADH）、1，4苯醌還原酶（QR）和苯醌氧化還原酶（QR2），與氨基酸代謝相關(guān)的甲酰四氫葉酸合成酶（FTHFS）；2）與植物物質(zhì)合成分解調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白，如