鴨圓環(huán)病毒ORF2和ORF3基因部分生物學特性的研究.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的新成員，為共價閉合的無囊膜單鏈環(huán)狀DNA病毒。鴨感染DuCV后表現(xiàn)為生長發(fā)育障礙、生長停滯，在出殼幾周內發(fā)病，生長停滯和羽毛形狀失常。研究表明DuCV有兩個主要的功能閱讀框，編碼復制蛋白Rep的ORF1和編碼衣殼蛋白Cap的ORF2。序列分析發(fā)現(xiàn)DuCV基因中還存在一個保守的ORF（命名為ORF3），它位于

2、ORF1的互補鏈上，但其具體功能尚不清楚。由于DuCV不能夠在體外培養(yǎng)，通過分子生物學方法揭示其基因的生物學特性與功能成為研究其致病性的主要手段。
　　 本研究主要進行了如下工作:
　　 1、ORF3作為DuCV功能性基因的驗證及ORF3蛋白凋亡活性的研究。本研究將DuCV的ORF3基因借助桿狀病毒表達系統(tǒng)在Sf9細胞中進行表達。通過IFA和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，ORF3蛋白存在于感染DuCV的陽性鴨體內。通

3、過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，在感染后24h、48h、72h，表達ORF3蛋白的重組桿狀病毒引起的Sf9細胞的凋亡比例明顯大于感染野型桿狀病毒而引起的Sf9細胞的凋亡比例(P＜0.05)。試驗結果表明DuCV的ORF3為一個功能性ORF，ORF3蛋白在DuCV的致病性方面可能發(fā)揮著促進宿主細胞凋亡的作用。
　　 2、DuCV的ORF2基因的部分生物學功能研究。軟件分析發(fā)現(xiàn)DuCV的Cap蛋白N端有兩個典型的核定位信號(NLS)。試驗中借

4、助桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了帶EGFP的完整的、敲除N端第一個NLS、敲除第二個NLS、敲除兩個NLS以及敲除C端36個氨基酸的各種Cap蛋白，通過其在Sf9細胞中的亞定位來研究其核定位功能。試驗發(fā)現(xiàn)敲除其中的任意一個NLS，剩下的另一個NLS均能促使Cap蛋白進入細胞核，而敲除位于N端36個氨基酸內的兩個NLS之后，該蛋白則完全喪失了進入細胞核的能力，結果表明這兩個假定的NLS均為功能性NLS，并均能單獨促使Cap蛋白進入細胞核。在Cap

5、蛋白的DNA綁定功能研究試驗中，借助桿狀病毒表達系統(tǒng)單獨表達了完整的、敲除N端第一個NLS、敲除第二個NLS、敲除兩個NLS以及敲除C端36個氨基酸的各種Cap蛋白，并對表達蛋白進行了純化。純化后的表達蛋白分別與構建的雙拷貝DuCV基因組的DNA在綁定緩沖液中混合后，進行了電泳遷移率變動分析(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)試驗。試驗發(fā)現(xiàn)完整的、敲除N端第一個NLS、敲除第二個NLS

6、、敲除C端36個氨基酸的Cap蛋白均能使DuCV的DNA出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，而同時敲除兩個NLS和蛋白酶消化后的Cap蛋白則喪失其阻滯DNA的功能。這些結果表明Cap蛋白的DNA綁定區(qū)域與NLS區(qū)域重疊，并且兩個NLS分別具有DNA綁定能力。
　　 將試驗中純化的桿狀病毒表達的DuCV完整Cap蛋白經(jīng)過雙氧鈾負染色后，通過電子掃描顯微鏡進行觀察。結果發(fā)現(xiàn)DuCV的ORF2編碼的32KD大小的完整Cap蛋白可以自我組裝成內部中空的類病毒