氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)DHA3-9菌株葡萄糖酸轉化及葡萄糖代謝酶系的研究.pdf

1、氧化葡萄糖桿菌Gluconobacteroxydans的細胞膜上存在眾多脫氫酶，可將多羥基底物氧化成對應的醛、酮、酸，并直接分泌到培養(yǎng)基中。細胞膜結合的葡萄糖代謝酶系具有底物特異性和不完全氧化性，這種獨特的不完全氧化性質可將葡萄糖轉化成D-葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、5-酮基-D-葡萄糖酸等化合物。D-葡萄糖酸是化學、醫(yī)學及食品等產品的重要中間體，市場需求量較大，促使人們不斷研究和改進D-葡萄糖酸的生產工藝。由于氧化葡萄糖桿菌具有

2、耐酸、耐高濃度葡萄糖的特點，與工業(yè)上廣泛采用的黑曲霉發(fā)酵法相比，利用氧化葡萄糖桿菌進行D-葡萄糖酸制備，具有環(huán)境污染小和生產工藝簡單的優(yōu)勢。
　　 本研究對從花朵中分離到的一株G.oxydansDHA3-9進行了葡萄糖氧化桿菌的D-葡萄糖酸轉化工藝的可行性探索及D-葡萄糖代謝酶系研究，主要結果如下:
　　 1.菌株DHA3-9的D-葡萄糖酸脫氫酶基因（gadH）的克隆與敲除:通過PCR得到D-葡萄糖酸脫氫酶基因gadH的

3、部分序列，通過DNA序列比對顯示該酶與G.oxydans621H的D-葡萄糖酸脫氫酶相似度為85％。采用同源重組的方法將DHA3-9的gadH成功敲除，使菌株不再積累2-酮基-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconate，2KGA)。
　　 2.菌株DHA-ΔgadH的高濃度D-葡萄糖酸轉化:用無CaCO3的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)DHA3-9能夠顯著降低副產物5-酮基-D-葡萄糖酸(5-keto-D-gluconate，5KGA)的

4、積累量，并利用該培養(yǎng)基在高濃度初始葡萄糖下培養(yǎng)DHA-ΔgadH，于30℃連續(xù)培養(yǎng)72h，最終D-葡萄糖酸產量達142.25g/L，但仍有50％葡萄糖未被轉化，未來可通過優(yōu)化發(fā)酵條件獲得更高的葡萄糖酸產率和葡萄糖利用率。
　　 3.菌株DHA3-9的膜結合D-葡萄糖脫氫酶基因(mgdH)的克隆與敲除:通過PCR得到D-葡萄糖脫氫酶基因mgdH的部分序列，通過DNA序列比對顯示該酶與G.oxydans621H的D-葡萄糖脫氫酶相似

5、度為97％。采用同源重組的方法將DHA3-9的mgdH成功敲除，使菌株轉化D-葡萄糖酸的能力降低98％。
　　 4.菌株DHA-ΔmgdH的葡萄糖代謝酶系研究:野生菌DHA3-9與突變菌ΔmgdH的葡萄糖代謝產物經離子色譜分析表明，ΔmgdH代謝產物中丙酮酸和二羥基丙酮濃度增加且檢測到野生菌代謝產物中沒有的乙酸。高濃度乙酸可顯著抑制突變菌ΔmgdH的葡萄糖代謝。結果表明，突變菌ΔmgdH主要通過另一條途徑進行葡萄糖代謝，即糖酵解