印尼熱泉菌產(chǎn)高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及其降解特性研究.pdf

1、本論文目的是從印尼熱泉菌中篩選具有產(chǎn)卡拉膠酶活性的菌株，并對高活性菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化;純化該熱泉菌所產(chǎn)卡拉膠酶，系統(tǒng)研究其酶學(xué)性質(zhì);分析該酶的降解特性，闡明其降解產(chǎn)物及其類型，以期為卡拉膠酶和卡拉寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持。
　　產(chǎn)卡拉膠酶熱泉菌株的篩選。從印尼泥樣中通過富集培養(yǎng)、稀釋涂布及劃線分離的方法獲得了94株菌，其中14株具有卡拉膠降解活性。并進一步通過平板劃線與盧戈氏碘液染色相結(jié)合的方式，對這14株菌進行復(fù)篩

2、，最終篩選出菌株Lc50-1的產(chǎn)酶活性最高，其活性為3.56U/mL。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察及16SrDNA序列等分析，最終確定菌株Lc50-1為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。
　　菌株Bacillussp.Lc50-1產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。分別以裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度、pH、碳源、氮源和金屬離子作為單一變量進行單因素實驗，篩選出對菌株的酶活具有顯著影響的單因素的取值范圍;用Design-Expert軟件對所有單因素進行Plac

3、kett-Burman實驗設(shè)計，篩選出影響菌株產(chǎn)酶活力的4個最主要因素:溫度、碳源、氮源和金屬離子;用最陡爬坡實驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，再對這4種因素用Box-Behnken設(shè)計及響應(yīng)面分析法進行回歸分析。經(jīng)過多次實驗確定菌株Bacillussp.Lc50-1的最佳產(chǎn)酶條件為:500mL三角瓶裝入200mL發(fā)酵培養(yǎng)基、搖床轉(zhuǎn)速150r/min、接種量1％、pH7.0、培養(yǎng)溫度47.5℃;最佳培養(yǎng)基組成為:蛋白胨0.25％、卡拉膠0.3％、K

4、Cl21.55mmol/L，優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活達到8.9U/mL，比優(yōu)化前提高了1.5倍。
　　菌株Lc50-1產(chǎn)卡拉膠酶的純化。菌株Lc50-1進行液體發(fā)酵培養(yǎng)24h，離心去菌體得到發(fā)酵上清液;通過30％-80％硫酸銨分級沉淀獲得粗酶，然后采用Q-SepharoseFastFlow離子交換層析和SephacrylS-200HR凝膠過濾層析技術(shù)對粗酶進行分離純化，純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測顯示為單一條帶，經(jīng)計算確定

5、此卡拉膠酶的分子量為38kDa。
　　菌株Lc50-1所產(chǎn)卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。研究結(jié)果表明，該卡拉膠酶的最適pH范圍為9.0左右，說明該酶在堿性環(huán)境中有助于該卡拉膠酶行使其生物學(xué)功能;最適反應(yīng)溫度為75℃，并且在30min之內(nèi)仍可以保持其活性在20％以上，具有較好的高溫耐受性;當(dāng)酶液中加入氯化鐵和氯化鎂時，卡拉膠酶活性喪失;酶液中加入EDTA、氯化鍶、氯化錳、氯化鉀、氯化鎘對卡拉膠酶的活性具有抑制作用;而酶液中加入氯化鈷、氯化

6、鈣、氯化銅、氯化鈉對卡拉膠酶的活性具有不同程度的增強作用，其中氯化鈣、氯化銅的作用尤為顯著使酶活分別提高了1.7倍和2.2倍;酶的專一性實驗表明該酶對λ-卡拉膠的降解具有強烈的專一性，對κ-卡拉膠、ι-卡拉膠、瓊膠和褐藻膠沒有水解作用。
　　菌株Lc50-1所產(chǎn)卡拉膠酶的降解特性。采用薄層色譜對菌株Bacillussp.Lc50-1所產(chǎn)卡拉膠酶的降解特性進行研究，結(jié)果表明，降解產(chǎn)物主要是λ-新卡拉二糖，與現(xiàn)已報道細菌的λ-卡拉膠酶