金霉素生物合成及其工業(yè)菌株代謝工程.pdf

1、金霉素(Ch Iortetracycline)屬于廣譜抗生素，它是從土壤微生物——金黃色鏈霉菌中（Streptomyces aureofaciens）分離出來，是四環(huán)素類抗生素家族第一個被發(fā)現的成員。該家族抗生素通過與細菌核糖體30S小亞基的氨酰-tRNA位點（A位點）的特異性結合，阻止肽鏈的延伸，抑制細菌蛋白質的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。由于抗菌譜廣，治療感染等疾病效果顯著，四環(huán)素類抗生素在臨床上取得了巨大的成功。加上四環(huán)素類抗生素具有

2、獨特的化學結構和抗菌機制，一直到現在，科學家們依然對其保持著濃厚的研究興趣。四環(huán)素類抗生素的研究已經涵括了生物化學、微生物學、結構生物學、合成化學、合成生物學和細胞生物學等多個學科。
　　早期關于四環(huán)素類抗生素生物合成機制的研究，主要集中在金黃色鏈霉菌一些隨機突變株產生的中間體上。但是由于遺傳操作瓶頸，四環(huán)素類生物合成的機制，特別是一些關鍵步驟，并沒有非常明確的結論。最近幾年，UCLA唐奕小組通過異源表達和體外生化實驗，報道了龜裂

3、鏈霉菌（Streptomyces rimosus）所產土霉素的生物合成的研究，包括起始單元和后修飾中的幾步氧化反應，人們逐漸了解了四環(huán)素類生物合成的一些細節(jié)。
　　本研究從一株經過長期誘變、高產金霉素的金黃色鏈霉菌工業(yè)菌株出發(fā)，首次建立了金黃色鏈霉菌的遺傳操作體系，旨在通過中斷目標基因所積累產物的結構和體外酶促生化反應，揭示金霉素生物合成的分子機制，為合成新的四環(huán)素類化合物和其它Ⅱ型PKS的研究提供理論依據。
　　本研究根據

4、已報道的四環(huán)素生物合成基因簇中氯代酶基因序列設計探針，從金黃色鏈霉菌基因組Fosmid文庫中成功克隆到完整的金霉素生物合成基因簇。前期工作中，用傳統(tǒng)穿梭質粒介導的同源重組方法，始終無法建立金黃色鏈霉菌的遺傳操作體系。根據分子生物學重組原理，我們改進了方法:利用Fosmid兩個較大同源臂（至少有一個在20kb以上）具有相對較高的同源重組效率，成功地進行了金黃色鏈霉菌的基因敲除。首先在E.coil BW25113中通過入-Red重組酶介導同

5、源重組，在Fosmid11D1(包含金霉素合成完整基因簇ctc)上將目標基因用oriT+ Spec片段置換;然后利用E coli ET12567與Streptomyces之間的接合轉移體系，將突變后的Fosmid與金黃色鏈霉菌染色體進行同源重組，得到最終的金黃色鏈霉菌突變株。本研究先后中斷了金霉素生物合成過程中氯代酶基因（ctcP）、合成起始相關基因（ctcT/ctcl）、所有環(huán)化酶基因（ctcD/F/H）和兩個氧化酶基因(ctcX/E

6、)，通過對突變株產物進行分析，更清晰地闡明了金霉素生物合成途徑。
　　與其它四環(huán)素類抗生素生物合成過程不同，金霉素生物合成過程中存在一步氯化反應，本研究首先將負責氯化反應的氯代酶(CtcP)進行了中斷。本研究的出發(fā)菌株金霉素的產量達到15 g/L(92％)，含有7.8％左右的四環(huán)素副產物（約1.2 g/L）;工業(yè)生產過程中，通過向培養(yǎng)基中添加2.0％(g/L)的溴化鉀(KBr)抑制氯化反應，用來生產四環(huán)素。將氯代酶基因敲除之后，突

7、變菌株ZT04發(fā)酵產物只積累“干凈”的四環(huán)素，其產量達到工業(yè)水平(18 g/L)。分別在天然啟動子和紅霉素強啟動子控制下，將ctcP基因回補到突變株ZT04，均恢復了產金霉素的能力。據此，我們初步推斷氯代酶負責的氯化反應應該是發(fā)生在最后一步——催化四環(huán)素在C7位加上一個氯原子得到金霉素。
　　為了進一步驗證氯代酶CtcP的功能，用在大腸桿菌中異源表達的CtcP（及其輔酶CtcQ）在體外重構了該步氯化反應。在體外實驗中，CtcP具有

8、酶分子典型特征:既具有酶分子催化底物的立體專一性，又表現出一定的底物柔性。在體外反應中，CtcP專一性地催化4S絕對構型的四環(huán)素底物(kcat=0.51±0.01 h-1)，但是不能夠催化4R構型的底物。實驗證實，4S構型的四環(huán)素類在體外能夠自發(fā)異構為4R產物。我們推測這種轉變是一種熱力學平衡過程，4R構型在熱力學上更穩(wěn)定，發(fā)酵產物中4S構型產物同樣向4R構型產物自動轉化。與此同時，CtcP能夠催化兩種四環(huán)素結構類似物——2-乙?；?2

9、-脫胺甲酰-四環(huán)素(2-ADTC)和6-脫甲基-四環(huán)素(6-DMTC)產生了痕量的氯代產物，只能通過LC-MS檢測到;另一種四環(huán)素結構類似物——土霉素則不能被氯代。
　　根據以上實驗結果，本研究在工業(yè)菌株中提高了氯代酶基因的表達水平，試圖將發(fā)酵過程中少量的四環(huán)素積累完全轉化為金霉素。構建具有紅霉素強啟動子PermE*的基因表達載體，串聯(lián)重復ctcP基因1至5個拷貝，通過鏈霉菌整合型質粒分別將它們整合到金黃色鏈霉菌的基因組上，5組突

10、變株不同程度的提高了金霉素產量，最終篩選到一株金霉素產量提高至173％(26 g/L)的突變株。RT-PCR結果顯示，金霉素產量的提高與氯代酶轉錄水平的提高相一致。但是，所有突變株四環(huán)素積累并不能夠完全消除，只是比例比原始菌株的7.8％略微下降(5.5％-7.1％)，推測原因可能是由于四環(huán)素和金霉素在發(fā)酵一開始就會被外排出細胞。至此，可以得出結論:氯代酶在金霉素生物合成過程中是最后一步反應，負責在四環(huán)素C7位置上加載氯原子，并且由于氯代

11、酶催化效率不高，氯代反應不完全，導致在金霉素發(fā)酵產物中還存在少量四環(huán)素。
　　在Ⅱ型PKS中，四環(huán)素類具有的一個特殊結構是其2-氨甲酰結構。已有文獻報道，天冬酰胺轉氨酶負責以丙二酸單酰CoA合成該起始單元，但是其反應底物和具體反應機制還沒有弄清楚。將ctc基因簇中的天冬酰胺轉氨酶基因(ctcT)中斷，意外地發(fā)現突變株積累以乙?；鶠槠鹗紗卧膬煞N產物:2-乙?；?2-脫氨甲酰-四環(huán)素(4S和4R，約1-2 g/L)。同時在ctc基因

12、簇中，我們推測另外一個?；鵆oA連接酶基因(ctcl)與起始單元2-氨甲酰合成有關:該基因只存在于四環(huán)素類生物合成基因簇中，將ctcl中斷，突變株仍產金霉素和四環(huán)素，只是產量均降低到出發(fā)菌株的1％左右。據此，我們認為四環(huán)素類生物合成過程中，天冬酰胺合成酶CtcT負責起始單元的轉氨，?；鵆oA連接酶Ctcl負責產物加載到CoA上;推測基因組上其它的?；鵆oA連接酶能夠識別乙?；鹗紗卧倭炕パaCtcl的功能，這個特征在其它Ⅱ型PKS中也

13、有報道。
　　將三個環(huán)化酶基因敲除后，根據突變株積累的產物，本研究明確了金霉素環(huán)化酶對應順序:環(huán)化酶CtcH負責金霉素B環(huán)的形成，環(huán)化酶CtcD負責金霉素A環(huán)的形成;環(huán)化酶CtcF與土霉素基因中OxyK同源，后者被證實負責第一個環(huán)——D環(huán)的形成;至于金霉素（包括四環(huán)素類）結構中C環(huán)的形成機制，仍然有待研究。
　　最后，我們通過基因敲除研究了氧化酶的功能:將氧化酶基因ctcX敲除后，金霉素（約5 g/L）和四環(huán)素產量均不到出發(fā)