肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞的檢測及其生物學特性.pdf

1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞的檢測及其生物學特性姓名：左國華申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（普外）指導教師：梁平20080501第三軍醫(yī)人學博十學何論文后，將微量肝癌HepG2細胞與外周血單個核細胞懸液混勻，再通過免疫磁性細胞分離，行免疫細胞化學鑒定，檢測免疫磁珠的特異性和敏感性，并計算癌細胞的回收率。(2)采集肝癌患者56例、肝炎和肝硬化患者19例、繼發(fā)性肝癌患者11例血樣，及18個健康志愿者的血樣作為陰性對照

2、。用Ficoll密度梯度離心與免疫磁珠技術(shù)首先對患者的外周血進行癌細胞的富集，然后運用FITC—CK標記富集的癌細胞，免疫細胞熒光技術(shù)對循環(huán)腫瘤細胞行形態(tài)學分析，并用巢式RT—PCR技術(shù)聯(lián)合檢測AFPmRNA和hTERTmRNA。(3)對8例富集分離出來的循環(huán)腫瘤細胞進行培養(yǎng)，通過測定生長曲線和細胞倍增時間評估細胞生長增殖能力，錨著獨立性試驗了解克隆集落能力，掃描電鏡觀察細胞表面超微結(jié)構(gòu)，以及裸鼠移植及成瘤觀察等方法研究其細胞生物學特性

3、。結(jié)果：(1)包被HAbl8的免疫磁珠能與HepG2細胞敏感而特異地結(jié)合，當單個核細胞與HepG2細胞比為1106：l時可檢測到癌細胞，結(jié)合免疫細胞化學方法可檢出外周血單個核細胞中572％的微量癌細胞，無假陽性。(2)在用肝癌HepG2細胞所做的2組預實驗中，免疫磁珠聯(lián)用增強了巢式RT—PCR的靈敏度、特異性，其靈敏度為5ml血中含有一個癌細胞。(3)在臨床樣品的實驗中，免疫磁珠富集后，結(jié)合免疫細胞熒光方法觀察肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細

4、胞，檢出陽性率為429％(24／56)，并與腫瘤的TNM分期有關(guān)；檢出細胞的形態(tài)可分為四類：中等細胞型、大細胞型、有核細胞碎片和無核細胞碎片。(4)肝癌患者外周血中AFPmRNA及hTERTmRNA的檢出陽性率分別為554％、482％。AFPmRNA及hTERTmRNA的檢出率和TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移臨床參數(shù)密切相關(guān)。當肝癌直徑大于5cm、多結(jié)節(jié)、伴門靜脈癌栓，AFPmRNA及hTERTmRNA的檢出率均明顯提高(PO05)。679％的肝

5、癌患者至少表達一種標志物，357％的患者兩種標志物均陽性。AFPmRNA和hTERTmRNA的檢出呈『F相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0363(P005)。hTERTmRNA在AFPmRNA陽性和陰性的肝癌患者檢出率分別為645％、28％(P005)。AFPmRNA在肝炎和肝硬化患者中檢出率為211％(HCCvs肝炎和肝硬化，PO05)，繼發(fā)性肝癌患者及健康成人均未檢出；hTERTmRNA在繼發(fā)性肝癌患者中檢出率為636％，而肝炎和肝硬化及健康成人中