乳酸脫氫酶的制備及其固定化研究.pdf

1、本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 培養(yǎng)基中添加葡萄糖50g/L，蛋白胨+酵母粉5g/L，維生素B1 0.1g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，NaC1 0.5g/L有助于產(chǎn)酶；優(yōu)化發(fā)酵條件為：250ml三角瓶中裝液量50ml，起始pH6.5，培養(yǎng)溫度35℃，搖床培養(yǎng)28h。平行五次實(shí)驗(yàn)，對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，RSD值為3.9％，說(shuō)明此最佳工藝條件操作穩(wěn)定性良好。 采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化了提取乳酸脫氫酶的最

2、佳工藝條件，凍融法的最佳工藝條件為：凍融次6次，解凍時(shí)間35min，解凍溫度40℃，磷酸鹽緩沖液pH5.8，平均酶活力為241.7U/ml；超聲波法的最佳工藝條件為：超聲功率400W，超聲時(shí)間10min，磷酸鹽緩沖液pH5.8，平均酶活為286.8U/ml；超聲波破碎具有操作簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，且提取效果要優(yōu)于凍融法。 啤酒酵母菌經(jīng)增菌誘導(dǎo)培養(yǎng)、超聲波破碎、高速冷凍離心后獲得乳酸脫氫酶粗酶液，經(jīng)30％～70％飽和度的硫酸銨分級(jí)沉淀

3、及透析脫鹽初步純化后，對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，該酶的最適反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)溫度高于65℃時(shí)酶蛋白基本上完全變性失活，55℃保溫60min酶活保存50％；最適反應(yīng)pH為6.8，在pH6.2～7.4范圍內(nèi)酶蛋白穩(wěn)定；低濃度的Na+、Mn2+和Co2+對(duì)該酶有激活作用，Ca2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+、Cu2+、Mg2+和Al3+對(duì)該酶有抑制作用；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、吐溫20、吐溫60能增強(qiáng)酶蛋白的熱穩(wěn)定性；酶的動(dòng)力學(xué)分析表明

4、：以丙酮酸為底物的Km=2.58mmol/L，Vm=306.75mmol/min。 建立了以納米級(jí)磁性殼聚糖微球(magnetic chitosan microspheres，M-CS)為載體固定化乳酸脫氫酶的方法，優(yōu)化了乳酸脫氫酶的固定化條件，考察了固定化酶的性質(zhì)。結(jié)果表明，M-CS呈規(guī)則的圓球形，粒徑在30nm左右，具有較好的磁響應(yīng)性。乳酸脫氫酶固定化適宜條件為：50mg磁性殼聚糖微球，加入20ml 0.25mg/ml乳酸脫

5、氫酶(蛋白質(zhì)含量)磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH7.0)，在4℃固定2h，在此條件下酶的吸附率為28％。M-CS容易吸附乳酸脫氫酶，但吸附的酶量受載體與酶的比例、溶液的離子濃度、溶液pH的影響明顯，而溫度對(duì)吸附的酶量的影響則相對(duì)較弱。固定化酶最適溫度為40℃，比游離酶升高5℃。游離與固定化酶最適pH均為6.8。與游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性有了明顯的提高。固定化乳酸脫氫酶與底物的親和力降低，Km值從2.58mmol

6、/L增至3.3l mmol/L。相同條件下連續(xù)進(jìn)行5批次操作，固定化酶酶活仍保持70％以上。在不加保護(hù)劑的條件下，4℃放置30d后游離酶僅保持20％以上的酶活力，固定化酶能保持60％以上的酶活力。采用海藻酸鈣凝膠包埋、戊二醛交聯(lián)的方法固定化乳酸脫氫酶，優(yōu)化了固定化酶的制備條件，測(cè)試了部分酶學(xué)性質(zhì)。1ml酶液和1ml4％的海藻酸鈉溶液的混合液，用注射器滴加到20ml 2％的CaCl2溶液中。25℃不斷攪拌固化4h后，過濾洗滌，將固體轉(zhuǎn)移到

7、20ml 0.5％戊二醛溶液中35℃交聯(lián)4h后，過濾、洗滌和干燥得到球狀固定化酶。酶經(jīng)固定化后，其熱穩(wěn)定性得到顯著提高，游離酶在65℃保溫1h酶蛋白完全變性失活，而固定化酶在65℃保溫1h仍可保持61％的酶活力。其最適酶促反應(yīng)溫度由35℃升至55℃。固定化酶的pH值穩(wěn)定性范圍變寬且向酸性方向移動(dòng)；其最適pH由6.8降至5.8。該固定化酶催化丙酮酸生產(chǎn)L-乳酸，反應(yīng)3h L-乳酸產(chǎn)率可達(dá)75％，固定化酶循環(huán)使用操作5次仍保持85％的酶活力