易栓癥家系抗凝血酶缺陷的基因診斷.pdf

1、背景：
　　人體主要有兩大抗凝系統(tǒng)，分別為抗凝血酶(antithrombin，AT)系統(tǒng)（包括抗凝血酶和肝素，主要抑制具有絲氨酸蛋白酶活性的凝血因子，如:FXa，凝血酶等）和蛋白C(protein C，PC)系統(tǒng)（包括蛋白C，蛋白S，血栓調(diào)節(jié)蛋白，內(nèi)皮細胞蛋白C受體等，主要滅活凝血因子Ⅴ和Ⅷ等）。而抗凝血酶系統(tǒng)中的抗凝血酶是人體最重要的抗凝因子之一，約占抗凝活性的70％。1965年Egeberg O.在報道一個家族性抗凝血酶缺陷癥

2、時第一次提出易栓癥(thrombophilia)一詞，意為血栓極易形成狀態(tài)，之后許多年內(nèi)，這種抗凝血酶缺陷癥成為遺傳性抗凝系統(tǒng)功能性障礙的代稱。1981年由Griffin JH等首次報道了遺傳性蛋白C缺陷癥;隨后，在1984年時，發(fā)現(xiàn)并報道了遺傳性蛋白S(protein S，PS)缺陷癥。目前國際上已報道的AT基因突變總計218種以上，報道的AT缺陷家系不到300例;已報道的PC基因突變總計262種以上，報道的PC缺陷家系300多例;已

3、報道的PS基因突變總計200種以上，報道的PS缺陷家系400多例。
　　蛋白S是一種能夠在在肝臟、巨核細胞和內(nèi)皮細胞中合成的抗凝因子，其合成過程中依賴維生素K參與。PS的分子量為70kD，基因定位于3號染色體1區(qū)1帶（3p11.1-3p11.2），含有14個內(nèi)含子和15個外顯子，基因序列全長80kb。PS是一種輔助因子，能夠輔助活化蛋白C(active protein C，APC)滅活FVa和FⅧa因子，并輔助APC能夠在血小板和

4、磷脂的表面結(jié)合，形成酶與底物的免疫復(fù)合物。PS在血漿中有結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)兩種。游離狀態(tài)是PS能夠發(fā)揮活性的狀態(tài)，約占總PS的35％;結(jié)合狀態(tài)是PS能夠與補體C4b結(jié)合蛋白(C4b-Bp)相結(jié)合，形成復(fù)合物而失去了輔助因子活性，約占總PS的65％。遺傳性PS缺陷癥是由于PS基因發(fā)生突變而引起PS的表達異?；蚬δ墚惓５囊环N常染色體顯性遺傳病，其常引起患者多部位的反復(fù)的形成靜脈血栓，如腸系膜靜脈血栓、股靜脈血栓、腓靜脈血栓、甚至肺靜脈血栓等

5、，動脈血栓少見。PS缺陷癥在臨床上可分為三型:Ⅰ型是PS含量的缺乏，但分子結(jié)構(gòu)與分子功能正常;Ⅱ型是PS質(zhì)的異常，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，不能發(fā)揮抗凝作用;Ⅲ型是僅有PS活性部分即游離部分的減少，而總的PS含量基本正常。
　　蛋白C是一種由肝臟合成的絲氨酸蛋白酶原，合成原料需要依賴維生素K的參與，是人體抗凝系統(tǒng)的一種重要的抗凝因子。PC的分子量為62kD，定位于2號染色體，含有8個內(nèi)含子和9個外顯子，基因全長11.2kb。蛋白S與蛋白C

6、、血栓調(diào)節(jié)蛋白（或稱凝血酶調(diào)節(jié)蛋白）和內(nèi)皮細胞蛋白C受體等一起組成蛋白C系統(tǒng)，參與人體的抗凝系統(tǒng)功能，在抗凝系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。其能夠以活化形式的蛋白C對FVa和FⅧa因子進行水解滅活使凝血過程中斷，并減少FXa與FVa的結(jié)合而發(fā)揮抗凝作用。遺傳性PC缺陷癥是由于編碼PC的基因發(fā)生突變的一種常染色體顯性遺傳病，可使APC生成障礙和FVa和FⅧa滅活障礙，而導(dǎo)致靜脈血栓形成，最常見于下肢深靜脈（如髂靜脈）血栓等。遺傳性PC缺陷癥和遺傳性

7、PS缺陷癥均可導(dǎo)致PC系統(tǒng)的異常，常引起多部位的、反復(fù)的靜脈血栓形成，亦可見于動脈血栓形成，其臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜。
　　抗凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶(serpins)抑制劑，主要具有抑制絲氨酸蛋白酶活性的凝血酶、FXa等因子，是人體重要的抗凝物質(zhì)?？鼓敢卜Q為抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)，由Seegers，Johnson和Fell在1950年代進行的早期科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，依次命名了四種AT（分別為ATⅠ、ATⅡ、ATⅢ、ATⅣ），但目前只發(fā)現(xiàn)

8、ATⅢ有臨床意義，通常用AT代指ATⅢ。遺傳性抗凝血酶缺陷癥屬于遺傳性易栓癥的其中一種，是由于抗凝血酶基因發(fā)生突變導(dǎo)致抗凝血酶表達異?；蚬δ墚惓Ｋ鸬囊环N常染色體顯性遺傳病，在人群中的發(fā)病率為萬分之二到萬分之五，中國人在靜脈血栓栓塞癥中的發(fā)病率為5.75％-7.14％?？鼓溉毕莅Y是導(dǎo)致遺傳性易栓癥的主要因素之一，多數(shù)患者為基因雜合突變導(dǎo)致。目前發(fā)現(xiàn)的抗凝血酶基因突變中，錯義或無義突變占56％，剪切位點突變占6％，堿基缺失或插入突變

9、占37％，基因重排占1％。國內(nèi)對抗凝血酶缺陷易栓癥的研究相對較少，迄今共報道了11個抗凝血酶缺陷家系。遺傳性抗凝血酶缺陷癥在臨床上可表現(xiàn)為極易反復(fù)形成人體某部位或多部位的靜脈血栓，如腸系膜靜脈血栓、髂靜脈血栓、下肢深靜脈血栓等，最常見部位為下肢深靜脈血栓，有些情況下也可在肺部形成血栓導(dǎo)致肺栓塞;少數(shù)動脈血栓可形成心肌梗死、甚至腦梗死。通常情況下，AT缺陷人群在AT基因發(fā)生突變的遺傳性因素作用下，發(fā)生靜脈血栓栓塞癥的風(fēng)險比正常人群增加了數(shù)

10、倍，但AT基因發(fā)生突變的人群不會完全都形成遺傳性AT缺陷癥，遺傳性AT缺陷癥的發(fā)生也同時受到獲得性誘因的影響，如手術(shù)、創(chuàng)傷、長時間制動、高齡、惡性腫瘤、口服避孕藥、妊娠等，在遺傳性基因突變和獲得性誘因并存的雙重作用下，遺傳性AT缺陷癥的發(fā)生率將會明顯增加。
　　至今，國內(nèi)研究報道的易栓癥家系仍不多，本研究擬以兩個易栓癥家系進行研究，分析其抗凝血酶活性、蛋白C活性和蛋白S活性等進行表型診斷，檢測其基因序列進行基因突變分析，以確定其所

11、患易栓癥的類型，并探討基因診斷在易栓癥類型診斷中的應(yīng)用。
　　目的：
　　1.對兩個易栓癥患者及其家系成員進行易栓癥表型診斷和基因診斷，并探討其家系成員發(fā)病機制。
　　2.對兩個易栓癥患者及其家系成員的抗凝血酶基因進行基因測序和基因突變分析，并比對人類抗凝血酶基因突變數(shù)據(jù)庫，以確定有無抗凝血酶基因相同位點突變的報道。
　　方法：
　　1.收集兩個家系資料，采集兩個家系成員的血樣標(biāo)本。
　　2.用發(fā)色底

12、物法檢測第一個家系9名成員和第二個家系4名成員的AT活性(AT:A)、蛋白S活性(PS:A)、蛋白C活性(PC∶A);AT抗原量(AT∶Ag)檢測采用免疫比濁法;同時檢測其肝腎功能、凝血四項、D-D二聚體、狼瘡抗凝物、抗心磷脂抗體等。
　　3.用Western blot檢測血漿中的AT分子量和含量。
　　4.對兩個家系成員的外周血進行全基因組DNA抽提，用PCR對AT基因的7個外顯子及其側(cè)翼序列進行擴增，經(jīng)純化后，用直接測序

13、法對兩個家系所有成員的擴增產(chǎn)物進行雙向測序分析并進行基因突變檢測。
　　5.同時篩查100例正常人的AT基因相應(yīng)位點序列并檢索人類核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(SNP)以排除基因突變的多態(tài)性;對兩個家系先癥者的FV基因的第10外顯子和凝血酶原的第14外顯子進行PCR擴增、產(chǎn)物測序，以排除FV Leiden突變和凝血酶原G20210A突變;對于突變位點查詢?nèi)祟惪鼓富蛲蛔償?shù)據(jù)庫進行查新檢索。
　　6.圖像掃描，數(shù)據(jù)整理，數(shù)據(jù)分析。<

14、br>　　結(jié)果：
　　1.第一個家系的先癥者AT∶A和AT∶Ag分別為48％和121mg/L，其AT基因的第6外顯子發(fā)現(xiàn)10381T del，其家系9人中有5名成員檢測到相同的缺失突變;
　　2.第二個家系的患者AT∶A和AT∶Ag分別為52.1％和266mg/L，該家系其他成員的PC∶A、PS∶A、AT∶A及AT含量等項目均正常，AT基因序列經(jīng)突變分析未發(fā)現(xiàn)異常。
　　結(jié)論：
　　第一個家系的先癥者及部分成員存