輔助生殖技術(shù)對子代基因組穩(wěn)定性的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分輔助生殖技術(shù)對動態(tài)突變頻率的影響
　　目的:
　　調(diào)查ART出生兒動態(tài)突變的發(fā)生頻率及其改變幅度，比較其與自然妊娠出生兒之間的差異，探討ART對動態(tài)突變基因三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)突變頻率和幅度的影響，為ART對DNA穩(wěn)定性的效應(yīng)研究提供證據(jù)。
　　材料和方法:
　　收集2008-2012年在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院完成分娩的ART家系147例，其中包括75例IVF家系和72例ICSI家系。同時收集在該院完

2、成分娩的99例自然妊娠家系，作為正常對照。采集新生兒的臍帶血和父母親的靜脈血，提取DNA。
　　以齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮（dentatoubral and pallidoluysian atrophy，DRPLA），脊髓延髓肌萎縮(spinal and bular muscular atrophy，SBMA)，脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅰ型(spinocerebellar ataxia，SCA1)，馬赫多-約瑟夫病(Machado-

3、Joseph，MJD)，亨廷頓病（Huntington's disease gene，HD），肌強(qiáng)直性肌萎縮(myotonic dystrophy，DM)，脆性Ⅹ綜合征(FragileⅩ syndrome，F(xiàn)raⅩ)7種動態(tài)突變疾病的致病基因:ATN1，AR,ATXN1，ATXN3，Huntington，DMPK, FMR-1基因為目的基因。
　　對所收集的246個家系(783個成員)，PCR擴(kuò)增上述7個基因的三核苷酸重復(fù)序列區(qū)，

4、瓊脂糖凝膠電泳，8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、DNA的測序分析完成各家系各基因位點三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)檢測，統(tǒng)計分析，比較各組間三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變頻率和拷貝數(shù)改變的幅度。
　　結(jié)果:
　　ART子代中共檢測2466個等位基因中，有52個等位基因發(fā)生突變，突變率為2.11％，與對照組子代突變率0.77％(10/1300)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中IVF子代突變率為2.48％(32/1288)，ICSI子代突變率為1.7

5、0％(20/1178)，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但是IVF與ICSI組之間無顯著性差異。在所有的這些被檢測家系中，各動態(tài)突變位點的三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)既有增加，也有減少，但均在其正常范圍內(nèi)。
　　根據(jù)不孕不育背景，我們再將IVF和ICSI再分成以下各小組:女性因素包括輸卵管性不孕，子宮內(nèi)膜異位癥，排卵障礙;男性因素包括少精，弱精，畸精及梗阻性無精子癥;男女雙方因素;不明原因不孕及其他因素。我們發(fā)現(xiàn)在ICSI組中，不孕因素

6、為女方因素(3.90％)及男女雙方因素(2.59％)的發(fā)生動態(tài)突變的頻率要高于單純男方因素(0.76％)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1.ART子代動態(tài)突變頻率高于自然妊娠子代。
　　2.ART技術(shù)及其不孕不育背景可能影響子代動態(tài)突變頻率。
　　第二部分 ART對子代胎盤DNA損傷修復(fù)基因的研究
　　目的:
　　研究ART子代胎盤組織中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)，揭示ART子代基因組不穩(wěn)定性原

7、因，并探索相關(guān)基因啟動子區(qū)域DNA甲基化率改變與基因表達(dá)異常間的關(guān)系。
　　材料和方法:
　　收集2009年-2013年間在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院剖宮產(chǎn)分娩的52例足月、單胎ART子代胎盤組織，其中包括32例常規(guī)IVF子代及20例ICSI子代。對照組為同期在我院剖宮產(chǎn)的32例自然妊娠子代。記錄母親年齡，出生體重，孕周等一般信息。
　　依據(jù)本論文第一部分結(jié)果顯示ART子代動態(tài)突變頻率增高這一結(jié)果，選擇動態(tài)突變相關(guān)D

8、NA損傷修復(fù)基因為目標(biāo)基因:OGG1:8-oxoguanine DNA glycosylase;MSH6: mutS homolog6;MSH2: mutS homolog2;MSH3: mutS homolog3;MLH1:MutL homolog1;MLH3: MutL homolog3;PMS2: postmeiotic segregation increased2;PMS1: postmeiotic segregation in

9、creased1;XPA: xeroderma pigmentosum,complementation group A; APEX1: apurinic/apyrimidinic endonuclease1;RPA1:replication protein A1，選取胎盤為靶組織，進(jìn)行ART子代動態(tài)突變不穩(wěn)定性的發(fā)生機(jī)制研究。
　　(1) ART子代胎盤中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)分析
　　利用熒光定量RT-PCR檢測ART

10、子代胎盤中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因OGG1,MSH6, MSH2, MSH3, MLH1, MLH3,PMS2, PMS1, XPA, APEX1和RPA1的表達(dá)變化。
　　(2) ART子代胎盤中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因修飾分析
　　應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)檢測OGG1，RPA1，PMS2，MSH6和XPA這五個基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)。
　　(3) ART子代胎盤中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因蛋白表達(dá)分析
　　通過weste

11、rn-blot檢測MLH1，OGG1，RPA1，PMS2，MSH2，MSH6和XPA各蛋白在胎盤組織的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1) mRNA水平:IVF與ICSI組中，PMS2，RPA1，XPA，MSH2，MSH6基因相比較對照組存在高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。IVF組中的MLH1與對照組和ICSI組比較存在顯著性高表達(dá);另外，與IVF組相比，ICSI組的MSH2，XPA，OGG1和RPA1基因也存在顯著性高表達(dá)，差異

12、具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2) DNA水平: OGG1，RPA1，PMS2，MSH6和XPA的CpG島的甲基化位點在IVF與ICSI組均與體內(nèi)組存在甲基化率的差異，并有統(tǒng)計學(xué)意義，與基因mRNA水平改變一致。
　　(3)蛋白水平: ICSI組的PMS2，MSH6和MLH1蛋白表達(dá)水平顯著高于IVF組及對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.ART操作及不孕不育背景可能子代胎盤組織DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表

13、達(dá)水平異常有關(guān)。
　　2.ART操作及不孕不育背景可能影響DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的DNA甲基化修飾。
　　3.DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的mRNA水平與蛋白水平不一致，可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。
　　第三部分 ART對出生小鼠老年時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)DNA氧化損傷及退行性改變的影響
　　目的:
　　研究ART出生小鼠在老年時期腦組織氧化損傷，DNA損傷修復(fù)基因及神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因，評估ART對出生小鼠老年時期中樞神

14、經(jīng)系統(tǒng)DNA氧化損傷及退行性改變的影響。
　　材料和方法:
　　應(yīng)用已建好的ART老年C57BL/6J小鼠模型包括:8只IVF小鼠、8只ICSI小鼠、8只體內(nèi)受精小鼠（每組小鼠雌雄比率相似），選擇8-OHdG為DNA氧化損傷標(biāo)記物，選擇DNA損傷修復(fù)基因Msh2，Apex1，Msh6, Ogg1，Pcna, Xpa和Mlh1;神經(jīng)退行性疾病相關(guān)Mapt，Bace1，Psen1,Psen2，App，Apoe和相關(guān)microRN

15、A以及Insulin/IGF-1信號通路有關(guān)基因為目標(biāo)基因。選取腦組織為靶組織，研究ART對出生小鼠老年時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)DNA氧化損傷及退行性改變風(fēng)險的影響。
　　(1) ART老年小鼠8-OHdG水平分析
　　利用ELISA檢測ART老年小鼠腦組織8-OHdG水平。
　　(2) ART老年DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)分析
　　利用熒光定量RT-PCR檢測ART老年小鼠腦組織Msh2，Apex1，Msh6, Ogg

16、1，Pcna，Xpa和Mlh1的表達(dá)變化。
　　(3) ART老年神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因表達(dá)分析
　　利用熒光定量RT-PCR檢測ART老年小鼠腦組織Mapt，Bace1，Psen1，sen2，App，Apoe，Igf-1，Igf-1r, Insr, Irs-1，Irs-2, miR-34與miR-101的表達(dá)變化。
　　(4) ART老年小鼠DNA損傷修復(fù)基因修飾分析
　　應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)檢測ART老年小鼠腦

17、組織相關(guān)損傷修復(fù)基因的CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　(1)8-OHdG水平:對照組8-OHdG為4.26±1.54pg/ml，IVF組9.59±4.27pg/ml，ICSI組為8.57±3.90pg/ml，與體內(nèi)組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。但I(xiàn)VF與ICSI組之間無顯著性差異。
　　(2) DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因mRNA水平:與體內(nèi)組相比，IVF和ICSI組的Ogg1，Apex1和Pcna基因表達(dá)顯著上調(diào);

18、IVF和ICSI組的Msh6，Msh2和Mlh1基因顯著性低表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。ICSI與IVF組相比，Pcna基因表達(dá)顯著上調(diào)。
　　(3)神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因mRNA和miRNA水平:與體內(nèi)組相比，ICSI組Psen1，Igf-1基因表達(dá)水平升高，Igf-1r，Insr，Irs-1，miR-34和miR-101表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;IVF組Igf-1基因表達(dá)水平升高，Igf-1r，Insr，Irs-1和m

19、iR-34表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。IVF與ICSI組相比，Insr和miR-101在ICSI組表達(dá)顯著性下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4) DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因DNA水平:Ogg1和Mlh1的CpG島的甲基化位點在IVF與ICSI組均與體內(nèi)組存在甲基化率的差異，并有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.IVF/ICSI出生小鼠老年時期腦組織可能存在較高氧化損傷風(fēng)險。
　　2.IVF/ICSI出生小鼠老