輔助生育技術出生子代的基因組學研究.pdf

1、研究背景：體外受精-胚胎移植技術開展至今已30年，到目前為止全世界范圍內已出生輔助生育技術(assisted reproductive technology，ART)子代約3,000,000，這些子代代表了人口的一個重要組成部分。已有報道提示在ART子代中健康風險增加，包括自然流產，低體重、極低體重、小于胎齡兒、出生缺陷、腦癱等，原因尚不明確。ART子代基因組表達的整體狀況如何，與自然受孕子代的基因組表達譜有無差別，有多大差別，其表達改

2、變主要源自于基因序列變化抑或表觀遺傳修飾的變化，受影響的基因主要包括哪些，目前皆缺少相關研究和評估。該狀況明顯滯后于人們對ART安全性問題日益增長的關注程度，也將會明顯影響ART在人類生殖健康方面應有作用的充分發(fā)揮和完善，因此對ART子代安全性進行系統(tǒng)性研究，深入探究健康高風險原因迫在眉睫。 近年來印跡缺陷，包括Beckwith-Wiedemann綜合征(Beckwith-Wiedemannsyndrome，BWS)、Angel

3、man綜合征(Angelman syndrome，AS)引起了人們的廣泛關注。多項病例對照研究提示在ART子代中印跡缺陷風險增加。印跡基因等位基因特異性表達的破壞與人類遺傳疾病、某些腫瘤及神經系統(tǒng)疾病相關，其親緣特異性表達需要正常水平的DNA甲基化，印跡基因的甲基化在配子發(fā)生過程中擦除并重新建立，在種植前后維持甲基化，而ART技術在配子發(fā)生、受精及種植前后階段操作配子和胚胎，這一時期恰恰是印跡基因甲基化重新編程的關鍵時期，因此可能導致印

4、跡基因甲基化異常。 目前ART操作與印跡基因印跡狀態(tài)的關系尚未明確。動物實驗提示操作及體外培養(yǎng)胚胎可能破壞基因組印跡，而且在配子形成過程中發(fā)生的表觀遺傳改變在種植后發(fā)育過程中不能糾正，可能與印跡基因表達異常及表型異常相關。但是，人類研究未發(fā)現可檢測的印跡基因表達異常，提示配子形成過程中建立的印跡在ART過程中穩(wěn)定保持。目前可獲得的有關ART與基因印跡疾病相關性的人類研究信息多來自ART子代出生后單個或幾個印跡基因檢測的報道，缺少

5、大樣本ART子代基因組印跡整體狀況及其改變的研究資料，有必要對ART子代印跡狀態(tài)進行系統(tǒng)性研究。 本研究首先通過染色體核型和微缺失檢測評估ART子代基因突變的風險。然后通過affymetrix全基因組表達芯片及熒光定量PCR進行全基因組表達譜和印跡基因的mRNA總表達水平的檢測以評估ART子代mRNA表達異常的風險。并進一步以ART子代中表達異常的印跡基因作為候選基因，檢測候選基因的單等位表達，研究DNA．甲基化與印跡穩(wěn)定性的關

6、系。從而在基因序列、基因表達及表觀遺傳修飾三個層面全面、系統(tǒng)地評估ART子代基因組學安全性。 第一部分：輔助生育技術出生子代基因突變的檢測 目的：研究無遺傳學高風險的ART男性子代中染色體異常和Y染色體微缺失發(fā)生情況，從而反映ART子代發(fā)生基因突變的風險。 材料與方法：收集我院出生的ART男性子代臍血37例，包括19例IVF子代及18例ICSI子代，以同期在我院分娩的60例自然妊娠男性子代為對照，采集臍血行染色體

7、核型分析和Y染色體微缺失檢測，并對其父代進行相應檢測，數理統(tǒng)計分析。 結果：自然妊娠子代及ART子代中均未發(fā)現染色體核型異常。37例ART子代中發(fā)現4例(10.8％)Y染色體微缺失，其中19例IVF子代中1例(5.3％)，18例ICSI子代中3例(16.7％)，ART子代中微缺失發(fā)生率顯著高于自然妊娠子代，P<0.05。微缺失子代的父代均未發(fā)現微缺失.1例存在Y染色體微缺失的ART子代合并尿道下裂。 結論：父代遺傳學背景

8、正常的ART男性子代Y染色體de novo微缺失風險較自然妊娠子代顯著增高，提示ART子代中基因突變的風險較自然妊娠子代中增加，可能與ART技術相關，需密切關注ART子代遺傳學安全性，進一步深入研究其機制及影響面，采取適當措施控制其發(fā)生。 第二部分：輔助生育技術子代全基因組表達譜及印跡基因表達狀況 目的：研究ART子代中基因表達譜與自然妊娠子代是否存在差異，闡明其差異程度及主要方面，同時分析ART子代中印跡基因的表達差異

9、，并篩選關鍵性的差異基因。 材料與方法：應用Affymetrix公司的Human GenomeUl33 Plus 2.0芯片，對ART子代和自然妊娠子代各8例進行檢測，利用芯片顯著性分析(significance analysisof microarray,SAM)比較兩組標本基因表達，采用分層聚類、GO(gene ontology)分類及信號通路(Pathway)分析對差異表達基因進行數據分析．收集我院出生的ART子代及自然妊

10、娠子代臍血各40例，對關鍵性差異表達基因及可能存在表達差異的印跡基因行熒光定量RT-PCR檢測。 結果：采用SAM法得到兩組間差異最為顯著的159個基因，對差異基因進行無監(jiān)督的分層聚類，可完全區(qū)分ART子代和自然妊娠子代．GO分析顯示差異基因中包括與生長和發(fā)育相關的基因。Pathway分析發(fā)現8條信號通路差異變化有顯著性，包括Toll樣受體信號通路等。熒光定量PCR檢測8個非印跡基因和9個印跡基因在ART子代和自然妊娠子代中的表

11、達情況，發(fā)現6個非印跡基因和3個印跡基因的表達在兩組間存在顯著性差異。 結論：部分基因在ART子代中表達改變，其中與生長發(fā)育相關的基因在ART子代中表達降低，可能為ART子代低體重的一個機制。ART子代中印跡基因總的表達狀況與自然妊娠子代相似，僅3個印跡基因在ART子代中表達改變，即PEGlO和L3MBTL表達上調，PHLDA2表達下調。 第三部分：輔助生育技術出生子代印跡基因PEG10、L3MBTL及PHLDA2的印跡

12、狀況 目的：研究ART子代臍血中PEG10、L3MBTL及PHLDA2的等位基因表達狀況，探討ART子代中印跡狀態(tài)異常的風險。 材料與方法：以60例ART子代為研究組，20例自然妊娠子代為對照，采用PCR直接測序及RT—PCR直接測序對PEG10、L3MBTL及PHLDA2的等位基因表達進行檢測。 結果：在自然妊娠子代中未發(fā)現印跡丟失情況。在ART子代中存在印跡丟失，其中，7例ART子代中存在PEG10基因印跡丟

13、失，發(fā)生率為31.8％(7/22)，1例ART子代中存在L3MBTL基因印跡丟失，發(fā)生率為5.56％(1/18)。PHLDA2基因在ART子代及自然妊娠子代臍血中均為雙表達。 結論：小部分ART子代臍血中印跡基因PEG10和L3MBTL的單等位表達被破壞，提示ART子代中印跡狀態(tài)的不穩(wěn)定性。 第四部分：輔助生育技術出生子代印跡基因PEG10及L3MBTL的甲基化狀況 目的：研究ART子代中印跡基因PEG10和L3

14、MBTL CpG島的甲基化狀況，評估ART子代中甲基化異常的風險，探索印跡丟失與CpG島甲基化的關系。 材料與方法：以4例ART子代和2例自然妊娠子代為研究對象，采用亞硫酸氫鹽測序的方法檢PEG10和L3MBTL的CpG島的甲基化狀態(tài)。 結果：在自然妊娠子代及ART子代中PEGl0啟動子區(qū)的22個CpG位點基本未發(fā)生甲基化，兩組標本問PEG10的甲基化狀況相似。L3MBTL基因在自然妊娠子代中所有CpG位點均為中等甲基化