基因工程重組西妥昔單抗質(zhì)量控制研究.pdf

1、目的：研究基因工程重組西妥昔單抗(Cetuximab)質(zhì)量控制方法，為質(zhì)最標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。 西妥昔單抗(Cetuximab)是一種重組人鼠嵌合型單克隆抗體，主要通過干擾癌細(xì)胞表面的表皮生長因子受體(EGFR)的蛋白質(zhì)生長，通過抑制表皮生長因子受體，減少癌細(xì)胞進(jìn)入正常組織的幾率，控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，達(dá)到抗癌目的，它是迄今第一個(gè)獲得批準(zhǔn)治療結(jié)腸癌的單克隆抗體藥物。由Imclone、Bristol-Myerssguilb 公司開

2、發(fā)的西妥昔單抗 (商品名為Erbitux)，F(xiàn)DA 2004年2月批準(zhǔn)為晚期直、結(jié)腸癌三線用藥。迄今為止，國內(nèi)尚無西妥昔單抗的系統(tǒng)研究，本課題旨在研究基因工程重組西妥昔單抗(Cetuximab)質(zhì)量控質(zhì)方法。 方法：本課題根據(jù)《中國生物制品規(guī)程》2000年版、《中華人民共和國藥典》2005年版3部以及《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》、《人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》的規(guī)定和要求，結(jié)合單克隆抗體類藥物的特點(diǎn)，主要

3、采用RP-HPLC和ELISA方法，對(duì)西妥昔單抗的理化性質(zhì)及質(zhì)量控制方面著重從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究，為新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。國內(nèi)目前還沒有同類單克隆抗體藥物，因此研究內(nèi)容均未見報(bào)道。 Cetuximab成品中由于制劑配方含有甘氨酸、甘露醇和吐溫80保護(hù)劑，用經(jīng)典Lowry法測(cè)定Cetuximab 成品蛋白濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的干擾。本文采用三氯乙酸和脫氧膽酸鈉先沉淀蛋白質(zhì)，以排除制劑配方的干擾，建立了測(cè)定Cetuximab

4、蛋白含量的TCA-Lowry沉淀法，并進(jìn)行了方法學(xué)研究。采用RP-HPLC法分析Cetuximab肽譜，用胰蛋白酶酶切Cetuximab，以Sephasil peptide C<,18>(4.6mm×250mm) 為色譜柱，以0.1％(v/v) TFA/水-0.08％(v/v)TFA/乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，用RP-HPLC分析裂解片段，以考察產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品之間同質(zhì)性以及不同批次之間產(chǎn)品的同一性。 建立了間接ELISA測(cè)定Cet

5、uximab抗體含量的方法，利用Cetuximab可與表皮生長因子受體(EGFR)特異性結(jié)合，采用EGFR包被酶標(biāo)板作為固相抗原，加入待測(cè)Cetuximab后再加入HRP-anti Human IgG FC，用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，酶聯(lián)儀測(cè)定450nm吸收值，以Erbitux為標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品OD吸收值對(duì)Erbimx濃度的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品OD吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出待測(cè)樣品中Cetuximab抗體含量，并進(jìn)行了方法學(xué)研究，用于

6、檢測(cè)培養(yǎng)液中抗體的表達(dá)水平。 建立了檢測(cè)Cetuximab抗體親和常數(shù)的非競爭ELISA法，經(jīng)確定最佳EGFR包被濃度范圍、最佳Cetuximab抗體濃度，得到不同濃度EGFR包板條件下與Cetuximab抗體結(jié)合反應(yīng)曲線，計(jì)算Cetuximab抗體的親和常數(shù)。用于篩選有高親和力抗體的陽性克隆株，并考察Cetuximab單克隆抗體的親和常數(shù)，從而建立產(chǎn)品Cetuximab相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 對(duì)Cetuximab 抗體的雜