基于羊毛甾醇14a去甲基化酶的新型抗真菌化合物的設(shè)計、合成與三維定量構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、真菌感染是一種常見病、多發(fā)病。由于近年來臨床上廣譜抗生素、抗腫瘤藥、免疫抑制劑的大量應(yīng)用及愛滋病的流行，導(dǎo)致人體抵抗力下降，真菌病尤其是深部真菌病發(fā)病率大幅度上升。同時由于抗真菌藥物長期大量地使用，真菌的耐藥性問題變得日益突出起來。因此，迫切需要開發(fā)出新一代廣譜、低毒、高效的抗真菌藥物。 羊毛甾醇14α去甲基化酶(CYP51)是真菌細胞膜生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶，抑制該酶將阻斷真菌細胞膜的生物合成而導(dǎo)致真菌細胞死亡，因此該酶是

2、抗真菌藥物設(shè)計的最重要的靶酶。 最經(jīng)典的羊毛甾醇14α去甲基化酶抑制劑是氮唑類化合物，已研制開發(fā)出以氟康唑、伊曲康唑和酮康唑等為代表的一系列抗真菌藥物。由于氮唑類藥物對深淺部真菌感染均有效，體內(nèi)代謝穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)簡單，便于生產(chǎn)等優(yōu)點，已成為臨床最主要的抗真菌藥物，對新型氮唑類抗真菌藥物的研究是目前的研究熱點。 但是氮唑類藥物具有嚴重的毒副作用，尤其是肝臟的毒性有時是致命的，使其臨床應(yīng)用受到很大的限制。如酮康唑具有嚴重的肝毒性

3、而主要用于局部治療，氟康唑具有抗菌譜窄對曲霉菌活性差的缺點，伊曲康唑不易通過血腦屏障，毒副作用發(fā)生率較高的缺點，并且臨床耐藥菌株也不斷出現(xiàn)。氟康唑和伊曲康唑與其他抗真菌藥物相比，毒副作用較小，但大劑量時還是能引起肝臟的損害。 目前研究表明：氮唑類藥物的毒性與其結(jié)構(gòu)特征和作用機理密切相關(guān)。氮唑類抗真菌藥物通過氮唑環(huán)N-3或N-4與真菌CYP51的血紅素鐵原子配位結(jié)合而發(fā)揮抗真菌活性。但羊毛甾醇14α去甲基化酶屬細胞色素P450酶系

4、，也是唯一被發(fā)現(xiàn)普遍存在于高等植物、真菌和哺乳動物體內(nèi)的P450酶。由于在人體中同樣存在大量細胞色素P450酶系，氮唑類抗真菌藥物亦可與人體細胞色素P450酶血紅素鐵原子配位結(jié)合，不可避免的產(chǎn)生毒性。存在著藥效與毒性難以分離的問題，使其發(fā)展和應(yīng)用受到極大的限制。 因此，氮唑類抗真菌藥物的毒性與抗真菌活性都是由于該類藥物的藥效基團氮唑環(huán)與真菌羊毛甾醇14α去甲基化酶的血紅素輔基Fe原子結(jié)合而產(chǎn)生。僅僅對氮唑類藥物進行結(jié)構(gòu)改造，不能

5、從根本上解決其毒性問題，必須根據(jù)靶酶的結(jié)構(gòu)來設(shè)計研究作用于靶酶不同位點的具有新的結(jié)構(gòu)類型的酶抑制劑。 由于CYP51的晶體結(jié)構(gòu)尚未見報道，季海濤等采用同源蛋白模建方法構(gòu)建了白念珠菌的CYP51活性腔三維結(jié)構(gòu)，對氮唑類藥物的藥物構(gòu)象與酶活性位點的對接進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)除了血紅素輔基Fe原子結(jié)合點外，另有四個與配體結(jié)合的氨基酸功能殘基區(qū)：S1為親水性氫鍵結(jié)合區(qū)；S2為疏水性區(qū)域；S3是由螺旋Ⅰ的N端殘基和位于螺旋B-meander

6、1的環(huán)中殘基組成的狹窄疏水性空腔；S4是鄰近β6-1/β1-4的另一個重要的氫鍵結(jié)合區(qū)。 本論文基于上述研究結(jié)果，以構(gòu)建的白念珠菌CYP51活性腔中氨基酸功能殘基為藥物結(jié)合點，避開能與氮唑類藥物結(jié)合的血紅素輔基Fe原子，設(shè)計全新結(jié)構(gòu)、新的結(jié)合模式的真菌CYP51抑制劑，期望發(fā)現(xiàn)高效低毒的新型抗真菌化合物。 本課題研究內(nèi)容為：1.基于白念珠菌CYP51活性腔中氨基酸功能殘基為藥物結(jié)合點(避開血紅素輔基Fe原子)，設(shè)計并合成

7、了新型2-氨基四氫萘類化合物，并考察了體外抗真菌活性。合成了109個化合物，所合成的化合物采用MS、IR和1H-NMR進行結(jié)構(gòu)確定。該類化合物在抗真菌研究方面是一種新的結(jié)構(gòu)類型，突破了氮唑類的傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)類型。 2.采用不對稱合成方法合成了具有光學(xué)活性的一系列化合物，以考察手性分子對抗真菌活性的影響。 3.考察目標(biāo)分子的體外抗真菌活性。體外抗真菌活性的測定按照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(NCCLS)，采用9種常見的人體致病真菌株

8、：白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌、緊密著色霉菌、煙曲霉菌、石膏狀小孢子菌和耐藥白念珠菌；以氟康唑為對照藥物。 體外抗真菌活性表明所合成的化合物均有不同程度的抗真菌活性，特別發(fā)現(xiàn)了一系列對于白念珠菌、耐藥白念珠菌和煙曲霉菌活性明顯高于氟康唑的化合物。 4.開展三維定量構(gòu)效關(guān)系研究及對接研究。采用比較分子力場分析法(CoMFA)和比較分子相似性指數(shù)分析法(CoMSIA)方法建立了目標(biāo)化合物的三維定

9、量構(gòu)效關(guān)系模型。 CoMFA和CoMSIA研究結(jié)果：交叉驗證值q2=0.618、0.513，說明模型具有較強的預(yù)測能力，實驗值與預(yù)測值具有較好的相關(guān)性。 提出了先導(dǎo)化合物與靶酶的結(jié)合模式：四氫萘環(huán)位于親水性區(qū)域S2，四氫萘環(huán)上的羥基、甲氧基與S4區(qū)域的殘基Tyr69、Val509形成氫鍵結(jié)合。N上脂肪族長碳鏈則伸入到S3區(qū)域狹窄疏水性空腔中，與酶發(fā)生疏水性相互作用。先導(dǎo)分子沒有與血紅素輔基亞鐵原子配位結(jié)合。對接結(jié)果說明設(shè)

10、計的2-氨基四氫萘化合物以活性腔中氨基酸功能殘基為藥物結(jié)合點，避開了能與氮唑類藥物結(jié)合的血紅素輔基Fe原子，從而可以避免氮唑類抗真菌藥物的毒性。 體外抗真菌活性實驗的結(jié)果、CoMFA和CoMSIA研究以及與靶酶三維結(jié)構(gòu)對接研究證實了目標(biāo)化合物與設(shè)計思想基本吻合，說明設(shè)計合成的2-氨基四氫萘類化合物是一類全新結(jié)構(gòu)類型的非氮唑類真菌羊毛甾醇14α去甲基化酶抑制劑。其優(yōu)良的抗真菌活性顯示出該類化合物具有很好的開發(fā)前景，可作為潛在的抗真

11、菌藥物進一步進行研究。本研究為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型抗真菌藥物提供了新的途徑。 本課題創(chuàng)新點：1.發(fā)現(xiàn)了全新結(jié)構(gòu)類型的真菌羊毛甾醇14α去甲基化酶抑制劑。跳出了傳統(tǒng)的氮唑類結(jié)構(gòu)類型。為抗真菌藥物研究提供新的結(jié)構(gòu)類型和研究途徑。 2.提出新的設(shè)計思想：以靶酶活性腔中氨基酸功能殘基為藥物結(jié)合點(避開血紅素輔基Fe原子)設(shè)計新型真菌CYP51抑制劑。 3.研究提出了這類化合物手性合成方法。 4.建立了三維定