KGF和TGF-β1噬菌體模擬肽改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量的實驗研究.pdf

1、創(chuàng)面愈合是一個組織缺損修復的復雜過程,異常的創(chuàng)面愈合會導致慢性難愈性創(chuàng)面和瘢痕增生。糖尿病患者和長期臥床患者經(jīng)常出現(xiàn)慢性難愈性創(chuàng)面,是臨床上常見的和需要解決的難題。瘢痕疙瘩是一種特殊類型的病理性瘢痕,影響患者的功能和外觀,治療后經(jīng)常復發(fā),難以成功防治。
　　 角質(zhì)細胞生長因子(Keratinoeyte growth factor,KGF)是一種上皮細胞特異性的多功能的生長因子,由間質(zhì)細胞產(chǎn)生,通過旁分泌機制分泌,與上皮創(chuàng)面愈合、

2、胚胎發(fā)育、腫瘤的形成與發(fā)展及免疫重建等方面關(guān)系密切。發(fā)生創(chuàng)傷時,創(chuàng)面下的成纖維細胞分泌KGF,KGF促進角質(zhì)化細胞增殖、遷移,以及細胞骨架重排,顯著影響上皮的創(chuàng)傷修復過程。然而,KGF的致瘤性限制了其廣泛應(yīng)用。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前已知的與瘢痕形成關(guān)系最密切、最具代表性的促細胞分裂誘導劑,是最強的纖維化促進因子。TGF-β1能夠促進血管化,誘導肉芽組

3、織形成,刺激細胞外基質(zhì)蛋白合成和沉積,同時抑制膠原酶產(chǎn)生,促進傷口纖維化。相對于正常皮膚,瘢痕疙瘩高表達TGF-β1。TGF-β1通過TGF-β1信號通路影響瘢痕的形成,TβRⅡ、Smad、MAPK、NF-kappa B和CTGF是TGF-β1信號通路的重要的細胞內(nèi)介質(zhì),通過調(diào)整TGF-β1信號通路可以達到防治瘢痕增生的目的,是目前的研究熱點,具有很好的研究及應(yīng)用前景。
　　 噬菌體展示肽庫技術(shù)是以單克隆抗體或者細胞為靶,篩選模

4、擬性抗原表位和配體的技術(shù),該技術(shù)已在受體阻斷劑和激動劑的獲得,多肽疫苗的輔助設(shè)計,多肽靶向藥物的開發(fā)等多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。噬菌體M13是一種較好的生長因子載體,具有低免疫源性、易擴散性、以融合蛋白的形式穩(wěn)定表達外源多肽、并能幫助外源多肽抵抗創(chuàng)面復雜環(huán)境的影響等優(yōu)點。
　　 為此,本研究從噬菌體隨機肽庫中篩選獲得KGF和TGF-β1的噬菌體模擬肽；檢測KGF噬菌體模擬肽對表皮細胞增殖的影響,并根據(jù)序列分析和離體細胞試驗結(jié)果,選擇

5、KGF的特異性序列,構(gòu)建表達pComb3-KGF活性肽,用于促進創(chuàng)面愈合；檢測TGF-β1噬菌體模擬肽對瘢痕疙瘩成纖維細胞的活性的影響,挑選具有競爭性抑制作用的噬菌體模擬肽,用于防治瘢痕增生。關(guān)于此方面的研究尚未見文獻報道。
　　 第一部分 KGF噬菌體模擬肽的篩選及促進表皮細胞增殖的研究
　　 目的：應(yīng)用噬菌體隨機7肽庫生物淘選具有促進表皮細胞增殖作用的KGF噬菌體模擬肽。
　　 方法以KGF單克隆抗體為靶,進

6、行4輪生物淘選噬菌體隨機7肽庫,測定噬菌體的滴度,計算噬菌體的回收率；4輪生物淘選后,隨機挑取單克隆噬菌體,進行ELISA檢測,選擇結(jié)合活性較好的單克隆噬菌體,對模擬肽的DNA序列進行測序,分析序列的相似性；應(yīng)用MTT方法檢測噬菌體模擬肽促進表皮細胞增殖的作用；應(yīng)用免疫熒光方法鑒定噬菌體模擬肽的細胞親和力；應(yīng)用RT-PCR方法檢測噬菌體模擬肽組及對照組中的KGFR、人β-防御素3、c-Fos和c-Jun的表達水平。
　　 結(jié)果：

7、經(jīng)過4輪生物淘選,特異性噬菌體模擬肽獲得了富集,從噬菌體隨機7肽庫中篩選獲得了25種噬菌體模擬肽,ELISA結(jié)果顯示部分噬菌體模擬肽具有較好的特異性；MTT結(jié)果顯示4種噬菌體模擬肽能夠促進表皮細胞增殖:免疫熒光鑒定結(jié)果顯示能夠促進表皮細胞增殖的噬菌體模擬肽具有較好的細胞親和力；RT-PCR結(jié)果顯示KGFR和人β-防御素3在KGF對照組和2種噬菌體模擬肽組中高表達,c-Fos和c-Jun在KGF對照組中高表達,而在噬菌體模擬肽組中表達不增

8、加。
　　 結(jié)論：從噬菌體隨機7肽庫中生物淘選到了KGF噬菌體模擬肽,能夠顯著促進表皮細胞增殖；2種噬菌體模擬肽能夠促進人β-防御素3的表達,有助于控制創(chuàng)面感染；噬菌體模擬肽不會促進腫瘤基因c-Fos和c-Jun的表達,安全性較好。
　　 第二部分 pComb3-KGF活性肽的構(gòu)建及促進表皮細胞增殖的研究
　　 目的：依據(jù)前述噬菌體生物淘選和離體細胞試驗的結(jié)果,選擇特異性的KGF序列,構(gòu)建展示pComb3-KGF

9、活性肽,檢測其促進表皮細胞增殖的作用。
　　 方法以噬菌粒pComb3為載體,選取載體的重鏈作為基因插入位置,以SpeⅠ和XhoⅠ作為限制性內(nèi)切酶。依據(jù)生物淘選和離體試驗的結(jié)果,選取4個序列,設(shè)計引物；應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得人皮膚真皮的成纖維細胞,提取人成纖維細胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法獲得目的基因；SpeⅠ和XhoⅠ雙酶切目的基因及噬菌粒pComb3,將目的基因亞克隆至pComb3；應(yīng)用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù),將插入的目的基因

10、展示于噬菌體表面；抽提純化噬菌體DNA,進行酶切、PCR和測序鑒定；應(yīng)用MTT方法檢測pComb3-KGF活性肽促進表皮細胞增殖的作用,應(yīng)用免疫熒光方法檢測pComb3-KGF活性肽的細胞親和力,應(yīng)用RT-PCR方法檢測pComb3-KGF活性肽對KGFR、人β-防御素3、c-Fos和c-Jun的表達水平的影響。
　　 結(jié)果：應(yīng)用RT-PCR方法獲得目的基因,并構(gòu)建在噬菌粒pComb3中,酶切、PCR和測序結(jié)果證實目的基因已成功

11、構(gòu)建在載體中；目的基因成功表達于載體表面；MTT結(jié)果顯示4種pComb3-KGF活性肽均能夠促進表皮細胞增殖；免疫熒光檢測結(jié)果顯示其具有較好的細胞親和力；RT-PCR結(jié)果顯示KGF及兩種pComb3-KGF活性肽能夠促進KGFR的表達,KGF及3種pComb3-KGF活性肽能夠促進人β-防御素3的表達,4種pComb3-KGF活性肽促進c-Fos和c-Jun表達的作用均弱于野生型的KGF。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建展示獲得pComb

12、3-KGF活性肽,能夠顯著促進表皮細胞增殖,能夠促進人β-防御素3的表達,有助于控制創(chuàng)面感染,但促進腫瘤基因c-Fos和c-Jun的表達弱于野生型的KGF。
　　 第三部分 TGF-β1噬菌體模擬肽的篩選及拮抗瘢痕疙瘩成纖維細胞活性的研究
　　 目的：檢測從噬菌體隨機7/12肽庫中生物淘選的TGF-β1噬菌體模擬肽對瘢痕疙瘩成纖維細胞的活性的影響,評估其拮抗瘢痕疙瘩成纖維細胞活性的作用。
　　 方法以人TGF-β

13、1單克隆抗體為靶,進行4輪生物淘選噬菌體隨機7/12肽庫,期望獲得包含類似于TGF-β1的外源性模擬肽的噬菌體模擬肽；隨機挑取單克隆噬菌體,進行ELISA檢測,對結(jié)合活性較好的單克隆噬菌體提取噬菌體DNA,進行測序,并進行序列分析；應(yīng)用MTT方法評估噬菌體模擬肽對正常成纖維細胞和瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響；應(yīng)用annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和流式細胞儀檢測噬菌體模擬肽誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的作用；應(yīng)用免疫熒光方法

14、檢測模擬肽的細胞親和力；應(yīng)用RT-PCR方法檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞中NF-Kappa B,CTGF和TβRⅡ的表達水平。
　　 結(jié)果：經(jīng)過4輪生物淘選,特異性噬菌體模擬肽獲得了富集,從噬菌體隨機7肽庫中篩選獲得了4種噬菌體模擬肽,從噬菌體隨機12肽庫中篩選獲得了10種噬菌體模擬肽；ELISA結(jié)果顯示具有較好的特異性；MTT結(jié)果顯示7種噬菌體模擬肽能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖,并促進其凋亡；免疫熒光鑒定顯示噬菌體模擬肽具有較好的