去鐵胺和鐵調(diào)素對高鐵環(huán)境下斑馬魚骨形成指標(biāo)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分去鐵胺在鐵過載相關(guān)骨形成抑制中的治療作用
　　目的:近年來,鐵過載被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。鐵過載可以促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和骨的再吸收。本文研究了鐵過載對斑馬魚成骨細(xì)胞分化和骨形成的影響,并進(jìn)一步探討去鐵胺(DFO)對鐵過載斑馬魚骨形成的治療作用,為鐵過載相關(guān)骨質(zhì)疏松癥的治療提供理論依據(jù)。
　　方法:以受精后第2天(2 dpf)斑馬魚幼魚為模型,用不同濃度的枸櫞酸鐵胺FAC(10、25、50、100μg/mL)干

2、預(yù)斑馬魚,于6 dpf進(jìn)行茜素紅染色并統(tǒng)計(jì)骨礦化面積;在上述100μg/mL FAC干預(yù)6 dpf基礎(chǔ)上,再移除FAC,用不同濃度的DFO(1、10、100μM)處理至10dpf。進(jìn)行茜素紅染色,對斑馬魚進(jìn)行椎體個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì),并用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測了各組之間成骨細(xì)胞特異性基因(runx2a、runx2b、bglap、spp1、alpl和col1a1a)的表達(dá)差異;用ICP/MS分析了各組間的鐵元素含量;用DCFH-DA檢測了各組間斑馬魚

3、體內(nèi)的活性氧(ROS)水平。
　　結(jié)果:(1)、用不同濃度 FAC處理斑馬魚后,斑馬魚骨礦化面積成劑量依賴性降低,與對照組相比,100μg/mL濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)下調(diào);與對照組相比,100μg/mL FAC處理時(shí)斑馬魚體內(nèi)鐵含量增加3.2倍(p<0.05);ROS水平增加4.2倍(p<0.05)。(2)、DFO可增加高鐵干預(yù)后斑馬魚的椎體個(gè)數(shù),且呈劑量依賴性效應(yīng)。成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)

4、較高鐵干預(yù)組有明顯提高。與高鐵干預(yù)相比,用10和100μM DFO處理使斑馬魚體內(nèi)鐵含量降低23.3％和58.9％(p<0.05);ROS水平同樣降低了37.5％和50.9％(p<0.05)。
　　結(jié)論:鐵過載通過增加斑馬魚體內(nèi)氧化應(yīng)激水平抑制斑馬魚骨形成,去鐵胺(DFO)通過螯合鐵過載斑馬魚體內(nèi)過多的鐵離子,降低鐵過載引起的氧化損傷,從而緩解鐵過載所致的骨形成抑制作用。
　　第二部分鐵調(diào)素在鐵過載所致的斑馬魚骨形成抑制中的

5、保護(hù)作用
　　目的:通過前期研究,我們已經(jīng)證實(shí)鐵過載可以抑制斑馬魚骨形成,為觀察鐵調(diào)素在鐵過載抑制斑馬魚骨形成中的預(yù)防作用,我們構(gòu)建了含有斑馬魚鐵調(diào)素的表達(dá)載體。以期為進(jìn)一步研究“鐵調(diào)素預(yù)防圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：以斑馬魚受精卵為模型,用不同濃度的枸櫞酸鐵胺FAC(10、25、50、100μg/mL)干預(yù),第4天進(jìn)行茜素紅染色并統(tǒng)計(jì)骨礦化面積,選擇FAC最適干預(yù)濃度;挑選發(fā)育至1-2細(xì)胞期的斑馬

6、魚受精卵,顯微注射入不同濃度的帶Flag標(biāo)簽的鐵調(diào)素 mRNA(0、50、250、500ng/μL),用Western Blot檢測斑馬魚體內(nèi)Hepcidin-Flag融合蛋白的表達(dá)情況。將注射了不同濃度鐵調(diào)素 mRNA的受精卵置于含100μg/mL FAC的培養(yǎng)液中,干預(yù)至第4天進(jìn)行茜素紅染色,用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測骨鈣素(bglap)及runx2a、runx2b基因的表達(dá)變化情況;用ICP/MS分析了各組間的鐵元素含量;用DCFH

7、-DA檢測了各組間斑馬魚體內(nèi)的活性氧(ROS)水平。
　　結(jié)果：(1)、成功構(gòu)建了斑馬魚鐵調(diào)素表達(dá)載體,在斑馬魚受精卵內(nèi)顯微注射體外轉(zhuǎn)錄的hepcidin-flag mRNA,能被有效翻譯成鐵調(diào)素蛋白。(2)、當(dāng)鐵調(diào)素濃度為250ng/μL及500ng/μL時(shí),能顯著預(yù)防鐵過載所導(dǎo)致的斑馬魚骨形成抑制作用(p<0.05),減緩FAC干預(yù)引起的斑馬魚成骨細(xì)胞bglap及runx2a、runx2b的表達(dá)下調(diào)(p<0.05);與FAC組