B7-H4在間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10 T1-2移植治療EAE中的作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步明確B7-H4分子在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2(以下簡(jiǎn)稱C3H10)增殖、生存及遷移等生物學(xué)行為中的作用;通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探討B(tài)7-H4分子在C3H10細(xì)胞移植治療小鼠EAE模型的體內(nèi)效應(yīng)。
　　方法:1、構(gòu)建B7-H4靶向shRNA轉(zhuǎn)染的C3H10細(xì)胞(C3H10-shRNA),應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B7-H4表達(dá)下調(diào)后,C3H10細(xì)胞的增殖能力、凋亡情況;檢測(cè)C3H10細(xì)胞表面趨化因子

2、受體CXCR4的表達(dá),間接觀察C3H10細(xì)胞遷移能力的改變;將C3H10、C3H10-shRNA等與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng),用FCM檢測(cè)其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用。
　　2、利用MOG35-55肽與完全弗氏佐劑混合,制作乳化劑進(jìn)行腋下皮下單點(diǎn)注射,百日咳桿菌疫苗毒素尾靜脈注射建立小鼠EAE(實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎)模型,分以下幾組進(jìn)行移植研究:(1)尾靜脈注射PBS的假手術(shù)組;(2)輸注PBS的造模EAE小鼠;(3)C3H10細(xì)胞移

3、植組;(4)C3H10-NC細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了未含靶向分子對(duì)照shRNA的C3H10)移植組;(5)C3H10-shRNA細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了B7-H4靶向shRNA的C3H10)移植組。其中C3H10細(xì)胞移植組、C3H10-NC細(xì)胞移植組、C3H10-shRNA細(xì)胞移植組在免疫后第6天分別經(jīng)尾靜脈在EAE模型小鼠體內(nèi)輸注1×106/只各組細(xì)胞,每日對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分、體重測(cè)量,組織病理檢測(cè)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失、軸突損害以及組織化學(xué)染色

4、檢測(cè)B7-H4表達(dá),評(píng)定不同干預(yù)手段對(duì)EAE病理過(guò)程的影響,明確B7-H4分子在C3H10移植治療EAE中的作用。
　　結(jié)果:1、下調(diào)C3H10上B7-H4,可部分逆轉(zhuǎn)C3H10對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用;并使C3H10細(xì)胞本身增殖減慢、凋亡增多;細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4表達(dá)下調(diào)。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)神經(jīng)功能缺損評(píng)分:尾靜脈輸注PBS的假手術(shù)組(正常對(duì)照組)小鼠無(wú)發(fā)病,輸注PBS的EAE造模組小鼠發(fā)病時(shí)

5、間早且癥狀重,神經(jīng)功能缺損評(píng)分高;經(jīng)C3H10細(xì)胞及C3H10-NC細(xì)胞移植組小鼠發(fā)病時(shí)間晚且癥狀嚴(yán)重程度較輕,神經(jīng)功能缺損評(píng)分維持在較低水平;C3H10-shRNA細(xì)胞移植組小鼠發(fā)病程度較C3H10細(xì)胞移植組重,但較EAE造模組小鼠嚴(yán)重程度較低。本次實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)病率達(dá)90％,死亡1只,死亡率2.5％。(2)體重測(cè)量:正常對(duì)照組小鼠體重呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì);EAE造模組小鼠體重在發(fā)病后一段時(shí)間呈下降趨勢(shì),后有緩慢增長(zhǎng),而C3H10-shRNA細(xì)

6、胞移植組小鼠體重變化基本與EAE造模組一致;C3H10細(xì)胞及C3H10-NC細(xì)胞移植治療組體重在觀察期間有波動(dòng),整體呈上升趨勢(shì),但體重增加幅度與正常對(duì)照組相比較緩。(3)脊髓病理檢測(cè)顯示,假手術(shù)組小鼠未見(jiàn)明顯異常,EAE造模組、C3H10細(xì)胞移植組、C3H10-NC細(xì)胞移植組、C3H10-shRNA細(xì)胞移植組均出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失及軸索損害表現(xiàn),但C3H10移植組小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失及軸索損害程度明顯較C3H10-shRNA