二甲雙胍通過NF-κB對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S抑制作用的研究.pdf

1、目的：不同濃度二甲雙胍作用乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，以及檢測(cè)細(xì)胞中NF-κBp65、未磷酸化IκB-α、Lin28B表達(dá)的情況。探討二甲雙胍能否通過作用NF-κB和Lin28B進(jìn)一步影響乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S的自我復(fù)制能力和多向分化潛能相關(guān)基因HMGA2和HRas的轉(zhuǎn)錄。
　　方法：NF-κB是細(xì)胞炎癥反應(yīng)鏈的重要蛋白復(fù)合物，NF-κB是由p65與p50組成，在失活狀態(tài)下，NF-κB是二聚體

2、結(jié)構(gòu)，正常狀態(tài)下IκB-α與NF-κB結(jié)合抑制其活性。二甲雙胍能夠抑制IκB-α的磷酸化，IκB-α的磷酸化被阻止，NF-κB的活性不能發(fā)揮。TNF-α可引起抑制劑IκB-α泛素化、磷酸化，IκB-α功能退化可激活NF-κB，p65解離后進(jìn)入核內(nèi)作用下游靶點(diǎn)，進(jìn)一步引起炎癥或腫瘤的發(fā)生。
　　首先，將乳腺癌細(xì)胞分為三組，對(duì)照組、3mM二甲雙胍組、10mM二甲雙胍，對(duì)照組不用二甲雙胍干預(yù)，3mM二甲雙胍組和10mM二甲雙胍組的細(xì)胞培

3、養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液中二甲雙胍的終濃度分別為3mM和10mM，三組分別干預(yù)細(xì)胞48h后，運(yùn)用WesternBlot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S中NF-κBp65、未磷酸化IκB-α、Lin28B的表達(dá)情況，10mM濃度二甲雙胍可引起三種成份表達(dá)均發(fā)生變化，選擇其進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　然后，再將乳腺癌細(xì)胞分為四組，對(duì)照組、TNF-α組、TNF-α+10mM二甲雙胍組、10mM二甲雙胍組。TNF-α+10mM二甲雙胍組細(xì)胞預(yù)先用終濃度5

4、0μg/ml的TNF-α干預(yù)24h，然后加入終濃度為10mM的二甲雙胍繼續(xù)干預(yù)。所有組共作用48h，提取細(xì)胞總蛋白和RNA進(jìn)行檢測(cè)，WesternBlot檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S中NF-κBp65、Lin28B的表達(dá)情況，RT-PCR檢測(cè)10mM二甲雙胍組與對(duì)照組中與乳腺癌細(xì)胞自我復(fù)制和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因HMGA2和H-Ras的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果:3mM二甲雙胍組與對(duì)照組相比，NF-κBp65表達(dá)減少（P＜0.05）

5、，未磷酸化IκB-α表達(dá)量增加（P＜0.05），Lin28B的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。10mM二甲雙胍組中NF-κBp65和Lin28B的表達(dá)均減少（P均＜0.05），未磷酸化IκB-α表達(dá)量增加（P＜0.05）。用50μg/mlTNF-α干預(yù)乳腺癌細(xì)胞48h后，細(xì)胞中NF-κBp65、Lin28B的表達(dá)均有明顯增加（P＜0.05）。TNF-α+10mM二甲雙胍組與對(duì)照組NF-κBp65、Lin28B均有明顯下降（P均＜0.05